Validação do modelo ex vivo de pele humana (hOSEC) para ensaio de absorção de insumos farmacêuticos

• Ano de defesa: 2021
• Autor(a) principal: Leite, Marcel Nani
• Tipo de documento: Tese
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP
• Palavras-chave em Português: Cell viability; Estudos de validação; hOSEC model; In vitro technique; Inoculação de neoplasia; Insumos farmacêuticos; Método in vitro; Modelo hOSEC; Neoplasm seeding; Pharmaceutical raw material; Validation study; Viabilidade celular
• Link de acesso: https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/17/17138/tde-11042022-111955/

Métodos alternativos ao uso de animais vêm sendo estudados e desenvolvidos ao longo dos anos, merecendo destaque a cultura de explante de pele organotípica humana (hOSEC). Considerada o modelo que mais se aproxima da pele humana em condições in vitro, apresenta estrutura 3D e todas as células da pele nativa, sendo um modelo versátil para o estudo de várias doenças e testes de novos fármacos. Nesse contexto, o objetivo deste trabalho foi validar o modelo ex vivo de pele humana (hOSEC) para ensaio de absorção de insumos farmacêuticos. Foram utilizados os fármacos Dacarbazina e Rifampicina. A viabilidade celular para ambos os fármacos foi testada pelo ensaio MTT em queratinócitos e fibroblastos primários e em linhagens imortalizadas da pele (HaCaT e 3T3). Também foi testada a sensibilidade de linhagens de melanoma humano A375, 1205 Lu e SK-MEL-103 tratadas com Dacarbazina nos tempos de 24, 48 e 72 horas. A viabilidade tecidual do modelo hOSEC tratado com os fármacos foi avaliada pelo método TTC nos tempos de 24, 48, 72 e 96 horas. A Dacarbazina e o modelo hOSEC foram validados por meio de cromatografia líquida de alta eficiência e, seguida à validação, a absorção do fármaco pelo tecido nos tempos de 30 minutos, 1, 3, 6, 12 e 24 horas foi analisada também por cromatografia. A estrutura da pele e apoptose pós-tratamento com Dacarbazina foram analisados por histologia corada com hematoxilina e eosina e TUNEL, respectivamente. Foi realizada a inoculação da linhagem A375 no modelo hOSEC e avaliada o local de aplicação e características das células por meio da coloração hematoxilina e eosina. Os testes de viabilidade frente à Dacarbazina mostraram que tanto nas células primárias quanto nas imortalizadas da pele foram consideradas viáveis (acima de 77%). Em relação as linhagens neoplásicas, a A375 foi a que se mostrou mais sensível em todas as concentrações, principalmente no tempo de 72 horas, diferentemente da 1205 Lu e SK-MEL-103, que se mostraram mais resistentes. Já utilizando a Rifampicina, foi observado uma sensibilidade maior quando exposta à concentração de 200 µg/mL nas quatro diferentes células estudadas. A validação do método foi linear, preciso e exato, demonstrando uma alta confiança para sua utilização. Em relação a absorção da Dacarbazina pela pele, foi observado que a concentração do fármaco na pele foi aumentando e consequentemente diminuindo no meio de cultura até 24 horas, atingindo concentração máxima pela pele de 36,36 µg/mL (18,18%) da dose inicial de 200 µg/mL no tempo de 12 horas. Dados histológicos mostraram que as camadas da pele foram mantidas estruturalmente em todos os tempos estudados. Não foram observadas células apoptóticas nas camadas epidérmica e dérmica. A inoculação das células A375 foi realizada de maneira adequada, intradermicamente, e as características de células neoplásicas foram mantidas. Portanto, nossos resultados confirmam que o modelo hOSEC pode ser um modelo alternativo para avaliar a dinâmica de absorção e distribuição de insumos farmacêuticos na pele, assim como também pode ser possível obter um modelo ex vivo de tumor na pele a partir da inoculação de células neoplásicas.