Participação da atividade redox e das armadilhas extracelulares de neutrófilos na gênese e desenvolvimento da lesão periapical induzida experimentalmente em camundongos

• Ano de defesa: 2023
• Autor(a) principal: Silva, Clara Marina Pereira Cavalcanti
• Tipo de documento: Dissertação
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP
• Palavras-chave em Português: Espécies reativas de oxigênio; Extracellular neutrophil traps; Lesão periapical; NETs; Oxidative stress; Periapical lesion; Reactive oxygen species; Stress oxidativo
• Link de acesso: https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/58/58135/tde-23102023-150057/

Diante do importante papel das espécies reativas de oxigênio (ROS) e das armadilhas extracelulares de neutrófilos (NETs) em diferentes patologias sistêmicas e seu potencial na modulação da resposta imunológica, faz-se necessária melhor compreensão dos seus efeitos nos tecidos assim como sua utilização como alvos para futuras estratégias terapêuticas. Assim, para abordar o tema proposto, foram desenvolvidos estudos divididos em 2 objetivos gerais: avaliar a participação da atividade redox durante o desenvolvimento da lesão periapical; e a relação entre espécies reativas de oxigênio e armadilhas extracelulares de neutrófilos na gênese e desenvolvimento da lesão periapical. Para o primeiro estudo, foram utilizados 42 camundongos wild-type (7 animais/por grupo). No grupo controle, os animais estavam com dentes hígidos e nos demais grupos tiveram lesões periapicais induzidas nos primeiros molares inferiores. Após os períodos de 2, 5, 7, 21 e 42 dias, os animais foram eutanasiados e as hemi-mandíbulas direitas foram submetidas ao processamento histotécnico de rotina e as lâminas obtidas foram coradas com hematoxilina e eosina (HE) para descrição das características do conteúdo do canal radicular e das regiões apical e periapical (microscopia convencional) e histomorfometria da área das lesões periapicais (microscopia modo fluorescente). Além disso, foram realizadas reações de imuno-histoquímica para avaliação da presença/ausência e localização das enzimas oxidantes mieloperoxidase (MPO) e óxido nítrico sintase induzível (iNOS) e das enzimas antioxidantes superóxido dismutase (SOD), glutationa redutase (GR) e catalase (CAT). Já as hemi-mandíbulas esquerdas foram submetidas ao processamento para a técnica de qRT-PCR e avaliação da expressão de RNAm das mesmas enzimas citadas anteriormente. Para os dados da morfometria realizou-se o teste Kruskal-Wallis e pós-teste de Dunn. Para os dados da imuno-histoquímica, realizou-se o teste de Kruskal-Wallis e pós-teste de Dunn e de Mann- Whitney. Ambas as análises estatísticas foram realizadas com o auxílio do software GraphPad Prism 9. Já para os dados de expressão gênica, realizou-se o teste ANOVA com pós-teste com contraste ortogonal por meio do software SAS/STAT®. Ainda, foi realizado o teste de correlação de Spearman para avaliar o grau de correlação entre a expressão de genes e o tamanho da lesão periapical. O nível de significância adotado para todas as análises foi de 5%. Os resultados permitiram concluir que no decorrer dos períodos, a lesão periapical progrediu. Houve aumento da expressão gênica das enzimas MPO, CAT, SOD e GR no dia 5, em comparação com o grupo controle (p<0,05). A expressão gênica da iNOS aumentou nos dias 21 e 42 dias em relação ao controle (p<0,05). Também foi possível observar correlação moderada entre MPO e CAT (0,7), entre iNOS e a lesão periapical (0,6) e correlação forte entre MPO e GR (0,8). Além disso, a imunomarcação de todas as enzimas se apresentou mais intensa nos períodos crônicos, porém apenas a MPO teve diferença entre esses grupos e o controle (p<0,05) e a iNOS, maior aos 5 dias, em comparação ao de 2 e 7 dias (p<0,05) e aos 42 dias, em relação ao de 7 dias (p=0,03). Assim, observou-se nos períodos iniciais do desenvolvimento da lesão periapical o aumento da atividade redox. Nas lesões crônicas, teve exposição prolongada de ROS, observadas pela imunomarcação. O aumento da expressão de iNOS teve correlação com o tamanho das lesões periapicais e sua marcação aos 42 dias, parece estar associada à destruição óssea e cementária, sugerindo o importante papel da atividade redox como mecanismo de defesa e na patogênese das lesões periapicais. Para o segundo objetivo proposto, de avaliação da relação das NETs e ROS no desenvolvimento de lesões periapicais, foram utilizados 42 camundongos wild-type (7 animais/grupo), sendo o controle o grupo de animais com entes hígidos e os demais grupos com lesões periapicais induzidas nos primeiros molares inferiores. Após os períodos de 2, 5, 7, 21 e 42 dias, as amostras foram avaliadas para descrição do canal radicular e das regiões apical e periapical, histomorfometria da área das lesões periapicais e contagem do número de neutrófilos. Além disso, foram realizadas reações de imunohistoquímica para avaliação da co-localização dos marcadores de NETs, elastase de neutrófilo (NE) e histona 3 citrulinada (H3Cit) e MPO e H3Cit. Adicionalmente, também foi avaliada a expressão gênica de NE e H3Cit por qRT-PCR. Foi observado maior número de neutrófilos nos períodos de 21 e 42 dias, com diferença com os demais grupos (p<0,05). A formação de NETs também foi maior nesses períodos (21 e 42 dias), evidenciada pela co-localização tanto de NE e H3Cit como de MPO e H3Cit. Após a obtenção dos resultados de ambos os estudos pode-se concluir que, durante o desenvolvimento da lesão periapical, pode-se evidenciar o stress oxidativo, maior atividade de neutrófilos e formação de NETs, especialmente nos períodos mais tardios de avaliação que correspondem à cronificação, o que pode indicar a relação entre a formação de ROS e a liberação de NETs com a destruição tecidual periapical.