Padronização de um ensaio imunoenzimático para detecção de vesículas extracelulares plasmáticas em amostras de pacientes com lúpus eritematoso sistêmico

• Ano de defesa: 2024
• Autor(a) principal: Lemos, Ana Patricia de Almeida
• Tipo de documento: Dissertação
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Palavras-chave em Português: Biomarcador; ELISA; lúpus eritematoso sistêmico; vesículas extracelulares; Lupo eritematoso; Biomarcadores; Vesículas Extracelulares; Produção intelectual; Biomarker; extracellular vesicles; systemic lupus erythematosus
• Link de acesso: https://app.uff.br/riuff/handle/1/34033

INTRODUÇÃO: As vesículas extracelulares (EVs, do inglês, extracelular vesicles) são pequenas estruturas liberadas de células em condições fisiológicas e patológicas, que carregam DNA, RNA, proteínas, lipídios e metabólitos, atuando na comunicação celular e na resposta imune, com potencial uso como biomarcadores. Sabe-se que pacientes com doenças inflamatórias crônicas, como lúpus eritematoso sistêmico (LES), possuem mais EVs circulantes de diversas origens celulares. Assim, a avaliação das EVs plasmáticas tem grande relevância para o entendimento de seu papel como biomarcadores para prognóstico e acompanhamento tanto no LES, como em outras doenças. Atualmente as EVs são identificadas e quantificadas, principalmente, por citometria de fluxo. Assim, implementar uma técnica de baixa complexidade e custo como o ensaio imunoenzimático permitirá a aplicação da detecção das EVs na área clínica. HIPÓTESE CIENTÍFICA: EVs plasmáticas, originárias de plaquetas (pEVs) e leucócitos (leuEVs), podem ser identificadas por método imunoenzimático, a partir de amostras de plasma de pacientes com LES. OBJETIVO: Padronizar a detecção de EVs plasmáticas por ensaio imunoenzimático a partir de amostras de pacientes com LES. MATERIAL E MÉTODOS: Desenhamos um ensaio imunoenzimático do tipo ELISA de captura para avaliação das pEVs (Anexina V+ CD41+) e leuEVs (AnexinaV+ CD45+). Na padronização avaliamos diferentes concentrações dos anticorpos de captura e secundário, esse marcado com biotina, além da diluição das amostras e do conjugado avidina-peroxidase. Após a padronização, o ELISA foi aplicado frente a um painel de vinte amostras de plasma obtidas de pacientes com LES atendidos no Hospital Universitário Antônio Pedro, além de grupo controle de oito amostras de plasma obtidas de indivíduos sem LES. Os resultados encontrados no ELISA foram analisados frente aos dados obtidos pelo método de referência, a citometria de fluxo. Os parâmetros laboratoriais, os dados clínicos-demográficos e a atividade do LES (classificação SLEDAI-2K) foram obtidos a partir da análise dos prontuários. RESULTADOS: Durante a padronização do ELISA, observamos melhores resultados na diluição das amostras em 1:100, as concentrações de 5 µg/ ml e 4 µg/ ml de anticorpos de captura e secundários, respectivamente; além do conjugado avidina-peroxidase na diluição 1:500. Dos 20 pacientes analisados, 80% eram do sexo feminino, com idade média de 41 (± 12) anos, dos quais 80% faziam uso de prednisona e 65% de hidroxicloroquina. Detectamos as EVs plasmáticas através do ELISA, com sensibilidade e especificidade de 75% e 62% para pEVs e 89% e 50% para leuEVs. Observamos que as amostras dos pacientes com LES apresentaram contagens mais elevadas de pEVs (p=0,001) e mais baixas de leuEVs (p=0,03) quando comparados ao grupo controle. Não observamos diferenças (p > 0,05) quando analisamos a detecção de EVs de acordo com o SLEDAI-2K e concentrações circulantes dos componentes séricos C3 e C4 do sistema complemento e anti-dsDNA. CONCLUSÃO: Detectamos EVs plasmáticas através do ELISA com sensibilidade e especificidade comparáveis à citometria de fluxo. Identificamos que pacientes com LES apresentam alterações nos níveis de EVs plasmáticas, independente da atividade da doença, sugerindo que essas EVs podem ser marcadores precoces de inflamação ou lesão celular.