Detalhes bibliográficos
| Ano de defesa: |
2023 |
| Autor(a) principal: |
Figueiredo, Lílian Louise Souza |
| Orientador(a): |
Não Informado pela instituição |
| Banca de defesa: |
Não Informado pela instituição |
| Tipo de documento: |
Dissertação
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| Tipo de acesso: |
Acesso aberto |
| Idioma: |
por |
| Instituição de defesa: |
Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP
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| Programa de Pós-Graduação: |
Não Informado pela instituição
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| Departamento: |
Não Informado pela instituição
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| País: |
Não Informado pela instituição
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| Palavras-chave em Português: |
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| Link de acesso: |
https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/17/17135/tde-05062023-102524/
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Resumo: |
A Doença de Gaucher (DG) é caracterizada pela deficiência da enzima lisossomal glicocerebrosidase (GCase). A terapia de reposição enzimática é considerada o padrão ouro no tratamento da DG. No Brasil, três enzimas recombinantes fazem parte do protocolo clínico e diretrizes terapêuticas para DG. Entretanto, essas enzimas são importadas e o país carece de autonomia no desenvolvimento de GCase. Por meio de evolução dirigida in silico, em estudos anteriores do nosso laboratório, foram desenvolvidas cinco variantes do gene GBA1 com códons otimizados e mutações missenses sítio-específicas que codificam cinco variantes de GCase humana recombinante: GBA-opt, GBA-7, GBA-8, GBA-9 e GBA-12. Como continuidade desses estudos, este projeto teve como objetivo caracterizar e selecionar dentre as cinco variantes, aquela mais promissora para ser utilizada no tratamento da DG. Por abordagem in silico foi realizada a predição das estruturas secundárias e terciárias do mRNA das cinco variantes. Em sequência, por ensaios in vitro, foram geradas 150 linhagens celulares humanas transgênicas com produção transiente de GCase humana recombinante: 60 para análise da expressão relativa do mRNA de GCase por RT-qPCR; 40 para avaliação da eficiência de transfecção por microscopia de fluorescência e citometria de fluxo após co-transfecção de construções plasmidiais contendo cDNA que codifica as variantes de GCase e cDNA que codifica a proteína verde fluorescente (GFP); e 50 para mensuração da atividade enzimática de GCase biologicamente ativa por meio de ensaio fluorimétrico. Dos resultados obtidos destacam-se seis: (1) a otimização de códons promoveu um aumento da estabilidade termodinâmica da estrutura secundária do mRNA de GCase humana com energia mínima livre 7,200 kcal/mol mais negativa na molécula otimizada (GBA-opt) (-832,470 ±4,970 kcal/mol) em comparação a GCase humana selvagem (-825,430 ±2,570 kcal/mol); (2) a estrutura secundária do mRNA da variante GBA-7 é a mais estável entre as variantes, com energia mínima livre de -844,000 ±4,860 kcal/mol; (3) o promotor hEF1a é mais eficiente na expressão do mRNA das variantes GBA-opt, GBA-7, GBA-9 e GBA-12 em comparação ao promotor CMV; (4) os níveis de expressão dos mRNAs das variantes GBA-7 e GBA-9 relativo ao gene referência RNAr 18S foram 16 x106 (±2,9 x106) e 11 x106 (±0,9 x106) Unidades relativas de expressão (URE) quando comparado com o mRNA GBA-opt 3 x106 (±0,5 x106) URE; (5) por meio do ensaio de co-transfecção plasmidial observou-se que a eficácia da transfecção foi similar entre as linhagens celulares humanas transgênicas geradas; (6) no que se refere a atividade específica de GCase, as linhagens celulares humanas transgênicas 293-FT_hEF1a-GBA-7+ e 293-FT_hEF1a-GBA-opt+ apresentaram níveis de 496,000 ±69,800 e 429,050 ±63,800 nmol de substrato hidrolisado/mg proteina/h enquanto as células não transfectadas apresentaram níveis da ordem de 128,700 ±8,400 nmol/mg/h. Concluímos que otimização de códons e mutações missenses sítio-específicas, determinadas por estudos de evolução dirigida in silico, favorecem a expressão do mRNA de enzimas GCase humana recombinantes in vitro. Demonstramos que GBA-7 é uma variante promissora para futuros estudos que visam aumentar a produção de GCase recombinante para obter uma terapia de reposição enzimática para DG de desenvolvimento nacional. |
