Geração e caracterização funcional de nova molécula recombinante da β-glicosilceramidase humana portadora de mutações sinônimas

• Ano de defesa: 2018
• Autor(a) principal: Coelho, Ana Carolina
• Tipo de documento: Tese
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP
• Palavras-chave em Português: β-glicosilceramidase; Doença de Gaucher; Enzima recombinante; Gaucher disease; Glucosylceramide beta; Lentiviral system; Recombinant enzyme; Sistema lentiviral
• Link de acesso: https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/17/17135/tde-04072024-142129/

A doença de Gaucher (DG), causada por mutações no gene GBA1, é a primeira doença de depósito lisossomal descrita e tornou-se o modelo para a descrição clínica e fenotípica para as doenças desse grupo. A terapia de reposição enzimática é o principal tratamento disponível para pacientes com DG, porém de alto custo. Assim, visando obter uma linhagem celular humana com expressão estável e elevados níveis da enzima lisossomal recombinante GBA humana, a hipótese desse estudo é que a agregação do uso de códons sinônimos, engenharia genética e sistema lentiviral permitirá a geração de uma nova molécula recombinante biologicamente ativa in vitro. Para alcançar esse objetivo, primeiramente foi realizada a transfecção transiente a fim de avaliar se os vetores lentivirais eram funcionais, o que foi demonstrado pelo aumento da atividade de GBA no sobrenadante das linhagens por meio do ensaio de atividade biológica da GCase. A partir desses resultados foram produzidas partículas lentivirais referentes às sequências de cDNA da GBA com os códons originais e sinônimos, ambas construções sob o controle do promotor HeF1α. Os títulos lentivirais foram cerca de 5,24x108 e 7,88x108 PV/mL, referente aos plasmídeos LV_HeF1α_GBA_WT e LV_HeF1α_GBA_SYN, respectivamente. Foram realizados seis ciclos de transdução com MOI entre 30-60, e após as transduções, as linhagens foram tratadas com puromicina. Seguido de clonagem celular das populações mistas foram selecionados os clones com níveis mais elevados da enzima recombinante. As análises de atividade biológica no sobrenadante da linhagem L18_293FT_GBA_WT_PM foi de 2,72 U/mL, enquanto que para L17_293FT_GBA_SYN_PM foi de 104,8 U/mL. Com relação aos clones que apresentaram níveis mais elevados de atividade da GBA obtivemos o clone 4 (19,73 U/mL) e o clone 9 (17,08 U/mL) para a L18, e os clones 15 (585,46 U/mL) e 16 (683,95 U/mL) para a L17. As análises de atividade intracelular da GBA para ambas as linhagens e seus respectivos clones mostraram níveis enzimáticos da ordem de 108,4 U/mg para a população mista da L18, 146,5 U/mg para o clone 4 e 159,8 U/mg para o clone 9. A atividade intracelular para a população mista da L17 foi de 307,5 U/mg e para os clones 15 e 16 foram cerca de 586,3 e 752,3 U/mg. O ensaio de espectrometria de massa mostrou a quantificação da enzima lisossomal recombinante no sobrenadante e intracelular produzida pela linhagem celular L18_293FT_GBA_WT_PM e os resultados mostraram níveis similares a GBA produzida pela linhagem celular virgem. Por outro lado, a linhagem L17_293FT_GBA_SYN_PM apresentou elevados níveis da enzima lisossomal recombinante GBA no sobrenadante da ordem de 38,39 µg de GBA e os clones 15 e 16 cerca de 60,15 e 53,23 µg de GBA, respectivamente. A quantificação da enzima GBA recombinante intracelular foi cerca de 14,08 µg para a população mista e para os clones 15 e 16 foi de 6,17 e 5,34 µg de GBA, respectivamente. Foi realizado também o escalonamento da população mista L17 e os resultados mostraram ser possível a expansão da produção da GBA em larga escala. Desta forma, concluímos que o sistema lentiviral foi efetivo e esse conjunto de informações levam a interpretação de que o uso de códons sinônimos pode consistir em uma estratégia promissora para obtenção de uma linhagem celular humana com elevados níveis da enzima lisossomal recombinante.