Investigação das metodologias de produção de Taq DNA polimerase Hot Start e suas implicações na atividade da enzima

• Ano de defesa: 2020
• Autor(a) principal: Torres, Naiara Utimura
• Tipo de documento: Tese
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP
• Palavras-chave em Português: Hot Start; PCR; Taq DNA polimerase; Taq DNA polymerase
• Link de acesso: https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/76/76132/tde-29092020-142751/

A reação de polimerização em cadeia (PCR, do inglês, Polymerase Chain Reaction) é um método amplamente usado em laboratórios de biologia molecular, análise forense, diagnóstico clínico e controle de qualidade em indústrias alimentícias. Taq DNA polimerase de Thermus aquaticus (Taq) é a enzima mais amplamente usada na PCR por sintetizar DNAs de diversos tamanho e natureza, além de manter sua atividade em diferentes meios reacionais. Apesar disso, essa enzima pode apresentar amplificações inespecíficas e formação de dímeros de oligonucleotídeos devido a sua atividade residual em temperatura ambiente, na qual a maioria das reações é preparada. Para solucionar esse problema, foram desenvolvidas Taqs que são ativadas somente após uma incubação em alta temperatura (do inglês, Hot Start Taq DNA polymerase). Essas enzimas são, usualmente, ligadas a biomoléculas ou grupamentos químicos que impedem a sua atividade a temperatura ambiente. Com a incubação em altas temperaturas, ou ciclo Hot Start, as biomoléculas e grupamentos químicos se desligam da polimerase, que recupera a sua atividade. Apesar de muito utilizada, apenas um único tipo de Taq Hot Start é produzida no Brasil, fazendo com que o valor e a disponibilidade dessa enzima sejam variados. Dessa forma, esse trabalho realizado em colaboração com a empresa Cellco Biotec do Brasil LTDA visou à produção de Taq Hot Start de alta qualidade por técnicas de mutagênese, ligação a anticorpo/aptâmero, reação com grupamentos químicos e precipitação de íons divalentes do meio reacional. Para isso, Taq foi produzida heterologamente em Escherichia coli e teve sua purificação otimizada através de quatro etapas cromatográficas. Visando avaliar a atividade enzimática, um método de determinação de unidades enzimáticas sem radioisótopos foi desenvolvido, baseado na fluorescência de uma molécula intercalante de DNA. Para a produção das Taqs Hot Start por ligação a aptâmero e anticorpo, diversas concentrações dessas biomoléculas inibidoras foram misturadas à enzima nativa, que teve sua atividade a 25 ºC avaliada em um termociclador de tempo real. Na versão Hot Start por modificação química, derivados de anidrido maleico foram ligados covalentemente à enzima, em diversas proporções molares. Já no tampão Hot Start, foram testados agentes tamponantes com base em íons fostato que promoveriam a precipitação do cofator enzimático Mg+2. Após a otimização de cada metodologia, todas as DNA polimerases Hot Start foram comparadas em eficiência, sensibilidade, baixa atividade a 25 ºC, amplificação de fragmentos de DNA com alta porcentagem de GC, amplificações complexas, desempenho em PCR multiplex e custo de produção. Diferente do esperado, a enzima mutante apresentou atividade residual a 25 ºC. Por outro lado, as estratégias de ligação de anticorpo e modificação química foram as que apresentaram o melhor desempenho na obtenção de enzimas Hot Start. Dessa forma, foi iniciada a produção de Taq DNA polimerases Hot Start nacionais de alta qualidade por meio da ligação de anticorpos e grupos químicos que apresentaram desempenhos iguais ou superiores às enzimas importadas. Esses resultados indicam a capacidade de produção local de novos produtos biotecnológicos de alto valor agregado para o mercado nacional e internacional, posicionando o Brasil entre os países detentores dessa tecnologia.