Identificação em larga escala de genes que medeiam a quiescência celular e a diferenciação para lactogênese induzidas pela laminina

• Ano de defesa: 2022
• Autor(a) principal: Botelho, Mayara Carolinne Silva
• Tipo de documento: Tese
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP
• Palavras-chave em Português: CRISPR/Cas9; Diferenciação para lactogênese; Extracellular matrix; Lactogenic differentiation; Matriz extracelular; Quiescence; Quiescência
• Link de acesso: https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/46/46131/tde-10082023-114909/

A proliferação é um dos atributos mais fundamentais dos sistemas vivos. Mas, ao contrário dos organismos unicelulares, as células dos organismos complexos param de proliferar, entrando em um estado denominado quiescência, mesmo na presença de nutrientes. Fatores presentes no microambiente celular, como a membrana basal (compartimento especializado da matriz extracelular (MEC) estruturado numa malha de laminina), desencadeiam e sustentam a quiescência, contribuindo para a diferenciação tecidual observada em organismos multicelulares. Para elucidar os mecanismos que fundamentam à aquisição e manutenção da quiescência e da diferenciação celular, nós realizamos um forward genetic screen em células expostas à uma MEC rica em laminina-111 (lrECM) que induz quiescência e diferenciação. Para isso, geramos células epiteliais mamárias não tumorais expressando o sensor fluorescente do ciclo celular FUCCI, assim como um repórter de diferenciação para lactogênese (βCas-CFP). As células foram transfectadas com uma biblioteca lentiviral CRISPR/Cas9 pooled de abrangência genômica e tratadas com lrECM e prolactina por 72h, tempo em que a maioria das células entra em quiescência e se diferenciam. Após isolamento por cell sorting em três populações distintas: mCitrine+ (proliferativa), mCherry+ (quiescente) mCherry+ /CFP+ (quiescente e diferenciada), as células foram sequenciadas para identificação do enriquecimento de guideRNAs que alvejaram genes que medeiam a aquisição de quiescência e diferenciação. Entre os principais candidatos, encontramos genes envolvidos no ciclo celular, organização de células epiteliais e vias metabólicas. Usando o silenciamento pós-transcricional em ensaios baseados em microscopia de fluorescência, validamos novos mediadores de quiescência e diferenciação. Este trabalho expande nossa compreensão básica sobre proteínas sinalizadoras que atuam durante a aquisição da quiescência e diferenciação em contextos fisiológicos, estabelecendo as bases para estudos translacionais em lactação e para o câncer, uma doença em que a regulação da quiescência é perdida.