Detalhes bibliográficos
| Ano de defesa: |
2023 |
| Autor(a) principal: |
Gallucci, Fábio Pescarmona |
| Orientador(a): |
Não Informado pela instituição |
| Banca de defesa: |
Não Informado pela instituição |
| Tipo de documento: |
Tese
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| Tipo de acesso: |
Acesso aberto |
| Idioma: |
por |
| Instituição de defesa: |
Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP
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| Programa de Pós-Graduação: |
Não Informado pela instituição
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| Departamento: |
Não Informado pela instituição
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| País: |
Não Informado pela instituição
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| Palavras-chave em Português: |
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| Link de acesso: |
https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/5/5153/tde-22082023-165100/
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Resumo: |
INTRODUÇÃO: O Câncer de Bexiga (CaB) é o décimo tipo de câncer mais comum entre ambos os sexos, responsável por cerca de 4% de todos os casos novos de câncer. É uma doença de morbidade, mortalidade e custos significativos, principalmente nos casos de estadiamento mais avançados. Com o avanço da pesquisa básica em oncologia, novos marcadores tumorais e mecanismos de evolução da doença têm surgido. Com o advento da técnica de CRISPR-Cas9 para edição genômica, novas perspectivas surgiram no estudo do processo de surgimento e progressão do câncer, como a análise do papel de moléculas específicas no processo de carcinogênese, como a metaloproteinase de matriz 9 (MMP-9). OBJETIVO: Analisar o efeito do bloqueio da expressão gênica da MMP-9 utilizando a técnica de CRISPR-Cas9 para edição gênica em células de carcinoma urotelial de bexiga T24-luc. MÉTODOS: Inicialmente, foi realizada a inserção das sequências de RNAs guias (sgRNA 1 e 2) para sequências-alvo no gene da MMP-9 no plasmídeo pX-330. Em seguida, os plasmídeos já modificados foram transfectados em linhagens celulares T24-luc e posteriormente, realizadas análises de expressão gênica e proteica por meio de RT-qPCR e Western-blotting, respectivamente. Para a análise do impacto funcional do bloqueio da MMP-9, foram realizados ensaios de proliferação celular e apoptose com citometria de fluxo, ensaio de formação de colônias, ensaio de migração celular por meio do teste de fechamento de ferida e ensaio de invasão celular através da técnica de Matrigel. RESULTADOS: Primeiramente, foi realizada a validação dos plasmídeos pX-330 após inserção dos sgRNAs da MMP-9 por meio de sequenciamento. Após a transfecção da linhagem celular T24, comprovada pela presença de GFP positiva na microscopia de fluorescência, observou-se a redução da expressão gênica de MMP-9 utilizando a sgRNA2 e redução da expressão proteica de MMP-9 com ambos sgRNAs. O efeito celular do knockout da MMP-9 foi observado por redução da capacidade de proliferação e aumento da apoptose celular em citometria de fluxo e redução da capacidade de formação de colônias in vitro, das células editadas em comparação ao controle. Observou-se, ainda, significativa redução na capacidade de migração e de invasão celular de células transfectadas.CONCLUSÃO: A edição gênica pela técnica de CRISPR-Cas9 para o silenciamento da MMP-9 em linhagem celular de CaB foi capaz de inibir funções como proliferação, migração e invasão celular, etapas essenciais no processo de progressão tumoral, bem como estimulou a apoptose das células editadas. Tais resultados não só corroboram com o papel da MMP-9 nos processos de tumorigênese como também sugerem a MMP-9 como possível alvo terapêutico |
