Investigação genética da obesidade sindrômica e desenvolvimento de modelos biológicos para estudo da síndrome de Xia-Gibbs

• Ano de defesa: 2023
• Autor(a) principal: Carvalho, Laura Machado Lara
• Tipo de documento: Tese
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP
• Palavras-chave em Português: AHDC1; deficiência intelectual; diagnóstico genético; genetic diagnosis; intellectual disability; iPSC; obesidade sindrômica; síndrome de Xia-Gibbs; syndromic obesity; Xia-Gibbs syndrome; zebrafish
• Link de acesso: https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/41/41131/tde-23032023-174554/

INTRODUÇÃO: A obesidade sindrômica é definida pela associação de obesidade com uma ou mais das seguintes características: atraso de desenvolvimento, deficiência intelectual, traços dismórficos e malformações congênitas. A maior parte dos casos não tem sua origem genética elucidada, o que impacta o aconselhamento genético da família e o desenvolvimento de métodos terapêuticos havendo, portanto, a necessidade de se ampliar estudos clínicos e genéticos. Nesta tese, a obesidade sindrômica foi o tema de estudo, inicialmente com a investigação genética de uma casuística dessa condição. Posteriormente, identificamos nessa casuística, entre outros, um paciente afetado pela síndrome de Xia-Gibbs, uma forma sindrômica de deficiência intelectual causada por mutações em heterozigose em AHDC1 que tem mecanismos fisiopatológicos pouco conhecidos e para a qual ainda não há associação reconhecida com obesidade. Decidimos então desenvolver modelos biológicos para seu estudo. OBJETIVOS: (1) Identificar variantes genéticas causais em uma coorte de 20 pacientes afetados por obesidade sindrômica que testaram negativo para as síndromes de Prader-Willi e X-Frágil, além de para os testes MLPA SALSA P064, P036 e P070; (2) desenvolver modelos biológicos (celular e animal) para estudo da síndrome de Xia-Gibbs. MÉTODOS: (1) Para casos com resultado negativo prévio em análise cromossômica por microarranjos (CMA), realizamos o sequenciamento de exomas (Agilent V5) dos pacientes e seus genitores (cinco trios). Para os demais, foi realizado sequenciamento de exomas dos trios (15 no total) com captura por sondas tanto para regiões codificadoras quanto para um backbone otimizado para avaliação de número de cópias de DNA (CNVs - copy number variation; OneSeq Agilent). (2) Além do paciente com mutação de perda de função em AHDC1 identificado na coorte de obesidade sindrômica, outros dois pacientes com síndrome de Xia-Gibbs foram recrutados. Para desenvolvimento de linhagens de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSC - induced pluripotent stem cells), reprogramamos células dos três pacientes. Para desenvolvimento do modelo animal (zebrafish), editamos o gene ahdc1 utilizando CRISPR-Cas9. RESULTADOS: (1) No grupo em que analisamos apenas SNVs e indels (por já ter diagnóstico negativo de CMA), tivemos uma taxa diagnóstica de 40% (2/5 genes MYT1L e GRIA3); no grupo em que combinamos as análises de CNVs, SNVs e indels, a taxa diagnóstica foi de 47% (7/15 genes MED13L, AHDC1, EHTM1, STAG2, KIAA0442, MEIS2 e SETD1A). Dois desses pacientes (com variantes causais em MYT1L e MED13L) foram reportados também como relatos de casos, além do artigo referente à casuística total. (2) Obtivemos três linhagens de iPSC com diferentes mutações de perda de função em AHDC1. Essas células têm morfologia típica de iPSC humanas, apresentaram expressão de fatores de pluripotência (SOX2, SSEA-4, OCT3/4 e NANOG) e capacidade de diferenciação nos três folhetos germinativos evidenciada pela expressão de PAX6, HAND1 e SOX17 nos corpos embrioides derivados in vitro. A linhagem de zebrafish obtida tem uma inserção de quatro pares de bases na região codificadora de ahdc1, é fértil e as frequências genotípicas de sua prole seguem proporções mendelianas. CONCLUSÕES: (1) As nove variantes causais identificadas em pacientes da coorte de obesidade sindrômica envolvem genes conhecidos de deficiência intelectual sindrômica; apenas dois desses genes (MYT1L e EHMT1) estão relacionados com síndromes em que a associação com obesidade é bem definida. Em investigações de casos de obesidade sindrômica, não se deve descartar a possibilidade de que a etiologia do quadro sindrômico possa ser independente da obesidade. Métodos de investigação abrangente do genoma (como microarranjos e sequenciamento de exoma/genoma) devem ser priorizados em detrimento de painéis de genes de obesidade sindrômica. (2) Os modelos biológicos que desenvolvemos são os primeiros para a síndrome de Xia-Gibbs e pretendemos futuramente utilizá-los para estudar sua ainda mal compreendida fisiopatologia, bem como para avaliar a nossa hipótese de que mecanismos neurais de fome e saciedade possam estar alterados nos pacientes. CONTRIBUIÇÕES DESTA TESE: Por meio do estudo genético de uma casuística de obesidade sindrômica, da apresentação de relatos de casos e de uma revisão abrangente sobre esse tema, esta tese contribuiu para a o diagnóstico e aconselhamento dos pacientes e suas famílias. Com o desenvolvimento de modelos para a síndrome de Xia-Gibbs, pretendemos investigar os mecanismos subjacentes às mutações em AHDC1, inclusive vislumbrando a proposição de alvos terapêuticos. Por fim, esta tese também envolve produções de divulgação científica que poderão ser utilizadas em ensino de genética, contribuindo para levar a ciência para além dos muros da nossa Universidade.