Avaliação da atividade e resistência à clivagem proteolítica de L-asparaginases recombinantes obtidas por reação em cadeia da polimerase propensa a erro

• Ano de defesa: 2016
• Autor(a) principal: Rodrigues, Mariane Augusta Domingues
• Tipo de documento: Dissertação
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP
• Palavras-chave em Português: Acute lymphoblastic leukemia; Asparagina endopeptidase; Asparagine endopeptidase; Biofármaco; Biopharmaceutical; Catepsina B; Cathepsin B; Error-prone polymerase chain reaction; Escherichia coli; Evolução sintética de proteínas; L-asparaginase; Leucemia linfóide aguda; Reação em cadeia da polimerase propensa a erro; Synthetic evolution of proteins
• Link de acesso: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/9/9134/tde-24082016-163433/

A L-Asparaginase II de Escherichia coli (EcA II) é uma enzima amplamente utilizada no tratamento da Leucemia Linfoblástica Aguda (LLA), atuando na depleção do aminoácido L-asparagina, o qual é fundamental para a multiplicação das células cancerosas. Contudo, o tratamento com a EcA II está associado a altos índices de hipersensibilidade, devido à formação de anticorpos anti-L-asparaginase e à clivagem da enzima pelas proteases sanguíneas asparagina endopeptidase (AEP) e catepsina B (CTSB). Também ocorre neurotoxicidade associada ao efeito L-glutaminase da enzima. O principal objetivo do presente trabalho é a obtenção de mutantes da EcA II (gene ansB) com equivalente eficiência catalítica, maior resistência à clivagem proteolítica e menor atividade glutaminase. Para este propósito, através da reação em cadeia da polimerase propensa a erro (epPCR) do gene ansB, foi construída uma biblioteca de 1128 clones expressos no vetor pET15b em BL21(DE3). Nenhum mutante com atividade asparaginásica equivalente à EcA II selvagem apresentou atividade glutaminásica inferior à esta. Dentre os clones triados obtivemos um mutante (T161I) resistente à clivagem proteolítica pela CTSB e dois mutantes (Q190L e P40S/S206C) resistentes à clivagem proteolítica por ambas AEP e CTSB. Estes três mutantes apresentaram atividade asparaginásica e glutaminásica equivalentes a EcA II selvagem. Nossos resultados mostram promissoras possibilidades de EcA II mutantes com maior estabilidade frente às proteases sanguíneas humanas e possivelmente menos imunogênicas.