Cultivo da linhagem Escherichia coli BL21 (DE3) ΔasnA/ΔasnB contendo plasmídeo com gene de L-asparaginase resistente a proteases plasmáticas

• Ano de defesa: 2023
• Autor(a) principal: Déssia, Vanessa Caroline
• Tipo de documento: Dissertação
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP
• Palavras-chave em Português: Biofármaco; Biopharmaceutical; Cultivo descontínuo; Escherichia coli; Fed-batch cultivation; L-asparaginase
• Link de acesso: https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/9/9134/tde-18082023-120219/

Utilizada há mais de 40 anos no tratamento da leucemia linfoblástica aguda (LLA), a L-asparaginase II da bactéria Escherichia coli tem como mecanismo de ação a depleção da asparagina livre no plasma sanguíneo. Células normais são capazes de sintetizar esse aminoácido, ao contrário das células leucêmicas, que sem quantidades suficientes de asparagina para absorver, entram em apoptose. Atualmente, o Sistema Único de Saúde Brasileiro (SUS) utiliza L-asparaginase importada para suprir a demanda interna, adquirida diretamente da empresa licitada no país, protocolo adotado após a grave crise de abastecimento enfrentada entre os anos de 2013 e 2017. A problemática envolvendo a aquisição da enzima e seu alto custo, somados à alta incidência de reações imunológicas indesejadas oriundas das formulações disponíveis atualmente no mercado, são fatores que tornaram relevante a viabilização da produção nacional, bem como o desenvolvimento tecnológico de novas versões da enzima. Deste modo, este projeto de mestrado foi desenhado para estudar, em agitador orbital, os parâmetros de cultivo e indução da bactéria Escherichia coli BL21 (DE3) ΔasnA/ΔasnBcomo sistema de expressão de uma molécula de L-asparaginase modificada por engenharia genética e construída em plasmídeo pET-28a. Testes iniciais de atividade enzimática da L-asparaginase EcAN24S/P40S/T161I/S206C expressada pela linhagem E. coli BL21 (DE3) ΔasnA/ΔasnB, indicaram atividade específica próxima a observada na proteína selvagem (WT) e outras proteoformas já estudadas. Também foi observada diferença de crescimento entre a cepa que teve seus genes deletados E. coli BL21 (DE3) ΔasnA/ΔasnB e a cepa E. coli BL21 (DE3).