Estratégias de indução, alimentação pós-indução e permeabilização de membrana em cultivo descontínuo alimentado de Escherichia coli BL21 (DE3) na produção de L-asparaginase II EcA (P40S/S206C)

• Ano de defesa: 2024
• Autor(a) principal: Chaves, Flaviana da Silva
• Tipo de documento: Tese
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP
• Palavras-chave em Português: Biofármaco; Biopharmaceutical; Cultivo descontínuo alimentado; E. coli; Fed-batch; L-asparaginase II
• Link de acesso: https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/9/9134/tde-09102024-173658/

L-asparaginase II é a enzima amplamente utilizada no tratamento da Leucemia Linfoblástica Aguda, atuando na depleção do aminoácido L-asparagina, o qual é fundamental para a sobrevivência das células cancerosas. Este trabalho tem como finalidade o estudo e desenvolvimento de uma tecnologia para produção de uma inovadora biomolécula: L-asparaginase II EcA (P40S/S206C), a qual apresenta duas mutações que permitem maior resistência à ação de proteases humanas. A fim de aumentar a expressão da proteína recombinante e compreender o comportamento celular durante o bioprocesso, em cultivo descontínuo alimentado de Escherichia coli BL21 (DE3) em alta densidade celular, estudaram-se distintas estratégias de alimentação durante a pós- indução e métodos não convencionais de indução. Também se estudou a permeabilização da membrana visando a exportação da enzima para o meio extracelular. A alimentação durante a pós-indução alterou significativamente a atividade de L-asparaginase II, de 340 U/L obtido em cultivo sem alimentação pós-indução para 30.770 U/L com a alimentação pós-indução no modo DO-stat. A indução da expressão de L-asparaginase II com base no aumento progressivo de IPTG (concentração final: 0,085mmol/gcélula) proporcionou atividades de 2070 U/gcélula e 113.575 U/L, valor que foi 19 vezes maior que o obtido com a mesma concentração de IPTG administrada por apenas um pulso. Em cultivo com indução por lactose adicionado em estratégia de alimentação DO-stat obteve-se a atividade máxima de L-asparaginase II de 49.120 U/L. Ao permeabilizar a membrana com adição de 0,8% de glicina, 55% da atividade total de L-asparaginase II foi quantificada em meio extracelular o que resultou num aumento da atividade total de aproximadamente 2 vezes: 211.192 U/L. Portanto, o modo de indução mais lento reduziu os efeitos nocivos do IPTG, o que não afetou na produtividade do biofármaco. A permeabilização de membrana proporcionou aumento da atividade de L-asparaginase II, uma vez que uma porção da proteína foi redirecionada e expressa em meio extracelular.