Avaliação do fator CIITA como potencial adjuvante molecular para vacinas e imunoterapias

• Ano de defesa: 2015
• Autor(a) principal: Palma, Mariana de Lucena
• Tipo de documento: Tese
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP
• Palavras-chave em Português: CIITA protein human; MHC class II transactivator protein; PML protein human; Proteasome; Proteassoma; Proteína humana CIITA; Proteína humana PML; Proteína transativadora MHC de classe II; Proteínas modificadoras pequenas relacionadas à ubiquitina; Small ubiquitin-related modifier proteins
• Link de acesso: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/5/5144/tde-24022016-153016/

O fator CIITA é a proteína responsável por controlar a transcrição de genes do complexo principal de histocompatibilidade de classe II (MHC II) envolvidos na apresentação antigênica a linfócitos T CD4+. A expressão desta proteína é complexa e célula-específica, dependendo de mecanismos de regulação transcricionais e póstranscricionais. Com o intuito de investigar o potencial do fator CIITA como adjuvante molecular, no presente estudo desenvolvemos e validamos sistemas de transferência gênica capazes de promover a eficiente expressão de CIITA em vários tipos celulares. Além disso, investigamos a regulação pós-traducional deste fator em células não hematopoéticas. Desta forma, foram produzidos um vetor plasmidial e um vetor lentiviral, ambos carreando a sequência do fator CIITA humano desenhada in silico visando a eliminação de elementos cis-reguladores, e otimizada para eficiente expressão em células humanas. A transfecção/transdução de três linhagens de células humanas não hematopoéticas resultou na eficiente expressão de CIITA com localização nuclear apropriada. Células expressando CIITA apresentaram síntese de novo do MHC II, confirmando a funcionalidade da proteína e validando ambos os vetores para a análise futura da atividade adjuvante do CIITA em imunizações gênicas. Ensaios preliminares de inoculação de explantes de pele humana com o vetor lentiviral evidenciaram a eficiente transdução e expressão do CIITA exógeno em células primárias. Em seguida, células dendríticas (DCs) derivadas de monócitos de indivíduos saudáveis ou infectados com HIV-1 foram transduzidas com o vetor lentiviral para confirmar a expressão do CIITA em células primárias e avaliar a aplicação desse sistema adjuvante no aprimoramento da vacina de DCs anti-HIV. DCs de indivíduos saudáveis ou infectados foram transduzidas com sucesso pelo lentivírus, o qual induziu uma produção prolongada do mRNA codificando CIITA. Entretanto, os vetores lentivirais induziram um aumento inespecífico da expressão de marcadores fenotípicos das DCs, incluindo as moléculas do MHC II, o que impediu a avaliação indireta da expressão e atividade do fator CIITA através da detecção da expressão aumentada do MHC II. Ensaios futuros irão avaliar se o fator transcricional é expresso pelas DCs transduzidas ou se essas células apresentam um controle mais restrito da expressão do CIITA comparadas às linhagens celulares avaliadas. Interessantemente, ensaios de western blot comparativos entre as três linhagens de células humanas transfectadas/transduzidas, juntamente com ensaios de inibição da degradação protéica pelo inibidor do proteassoma, nos permitiu descrever um novo mecanismo de regulação pós-traducional do CIITA. Aqui, nós identificamos que cada tipo de célula não hematopoética mantém níveis específicos da proteína, e portanto, da sua atividade transcricional, através da regulação da degradação do CIITA pelo proteassoma. Essa regulação é mediada pela modulação dos níveis das proteínas da leucemia promielocítica (PML) acopladas a proteínas SUMO (modificadores pequenos similares à ubiquitina), modificação pós-traducional requerida para a interação PML-CIITA que impede a degradação pelo proteassoma. Esse novo mecanismo aqui descrito contribui para o entendimento ainda incipiente da regulação pós-traducional do fator CIITA em células não hematopoéticas e pode ter implicações importantes na aplicação dessa proteína como adjuvante molecular para imunoterapias