Identificação e caracterização funcional de compostos sintéticos indutores do efeito imunomodulador em células estromais mesenquimais

• Ano de defesa: 2023
• Autor(a) principal: Costa, Péricles Natan Mendes da
• Tipo de documento: Tese
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP
• Palavras-chave em Português: Cell therapy; Célula estromais mesenquimais; Immunomodulation; Imunomodulação; Indirubin; Indirubina; Large-scale screening; Mesenchymal stromal cell; Terapia celular; Triagem em larga escala
• Link de acesso: https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/17/17153/tde-05062023-135252/

Na terapia celular, o uso de células estromais mesenquimais (MSC) se dá pela sua propriedade imunomoduladora. Neste processo, a atividade parácrina das MSC gerencia a efetividade das células do sistema imunológico melhorando o prognóstico de doenças inflamatórias. Neste contexto, as MSC são estimuladas pela citocina inflamatória TNF-α, levando ao aumento da ciclo-oxigenase dois (COX-2). Isso resulta na síntese de prostaglandina E2 (PGE2): principal fator solúvel liberado pelas MSC. Baseado nisto, propõe-se que moléculas que mimetizam a ação da citocina atuam como novos moduladores de COX-2 e potencializam a ação as MSC na terapia. O objetivo deste estudo foi realizar um ensaio de triagem em larga escala para seleção de novas moléculas com ação sobre a MSC. Foram isoladas MSC de cordão umbilical (n=3) e caracterizadas quanto a morfologia, o perfil imunofenotípico e a capacidade de diferenciação. Após isso, testou-se nas três linhagens a modulação do eixo TNF-α- COX-2 quanto a secreção de PGE2 por ELISA e expressão gênica e proteica de COX-2 por qPCR e Western Blot (WB), respectivamente. A linhagem escolhida seguiu para a triagem em larga escala. Para tanto, usou-se qPCR e o método de ΔΔCT. No ensaio, as células foram tratadas com a condição de modulação positiva TNF-α, modulação negativa DMSO 0,5%, condição controle (somente meio base) e uma biblioteca de 707 moléculas, individualmente, a 50 µM. A molécula selecionada na triagem seguiu para a validação por qPCR, WB e curva dose-resposta. As MSC do cordão umbilical (UC-MSC, n=3), apresentaram-se como células aderentes ao plástico e fibroblastoides. Mais de 95% delas foram positivas para CD73, CD90 e CD105 e mostraram ausência (menos de 2%) de marcadores hematopoéticos e HLA-DR. Todas foram capazes de se diferenciar em adipócitos, osteócitos e condrócitos. Dentre as três linhagens, UC-MSC 01-03, a 03 apresentou o maior nível de secreção de PGE2 e acréscimos na expressão gênica e proteica de COX-2. Logo, ela foi a escolhida para a triagem. As sondas de hidrólise para B2M (gene endógeno) e COX-2 (gene alvo) foram otimizadas em cerca de 90% de eficiência e apresentaram comportamento semelhante. Com base na distribuição da expressão gênica dos controles TNF-α e DMSO, foram estabelecidos os parâmetros de seleção. A molécula selecionada foi a indirubina, um produto natural derivado de plantas e apontado na literatura como anti-inflamatório. Nas concentrações de 25 e 50 µM, ela aumentou a expressão gênica de COX-2 em cerca 4 a 8 vezes, respectivamente. No WB, essas concentrações demonstraram bandas com maior intensidade em comparação às demais. A curva de dose-resposta indicou que é necessário investigar concentrações mais altas para classificar nível da modulação e determinar o EC50. Até o momento, conclui-se que o ensaio de larga escala proposto foi capaz de selecionar a indirubina como molécula moduladora de COX-2. No entanto, ainda é necessário investigar a intensidade desta modulação e aplicação funcional na propriedade imunomoduladora das UC-MSC.