Caracterização de células e moléculas do sistema imune inato envolvidas na progressão e tratamento de lesão periapical e no desenvolvimento da doença periodontal

• Ano de defesa: 2019
• Autor(a) principal: Pucinelli, Carolina Maschietto
• Tipo de documento: Tese
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP
• Palavras-chave em Português: Apical periodontitis; Cell culture; Cultura de células; IFI16; Immunohistochemistry; Imunohistoquímica; Lesão periapical; Luminex®; M1 macrophages; M2 macrophages; Macrófagos M1; Macrófagos M2; Periodontite; Periodontitis; qRT-PCR
• Link de acesso: https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/58/58135/tde-30092022-102310/

O sistema imune inato representa a primeira de linha de defesa do nosso organismo. Receptores de Reconhecimento de Padrões (PRRs) são expressos pelas células desse sistema, como os macrófagos, reconhecendo os micro-organismos e apresentando os antígenos ao sistema imune adaptativo. Dentre os PRRs destaca-se o IFI16 (Proteína induzível por interferon gama 16), uma proteína multifuncional com ação anti-inflamatória. No entanto, o papel da IFI16 na Odontologia ainda é pouco conhecido. Assim, o primeiro o objetivo desse trabalho foi caracterizar a fonte celular da IFI16 na progressão da periodontite induzida experimentalmente em camundongos, a fim de verificar se as células derivadas da medula óssea poderiam ser a fonte da expressão da IFI16 na periodontitite. Inicialmente foi realizada a depleção da medula óssea de animais wild-type (WT) e de animais Ifi204-/- (ortólogo para IFI16). Em seguida, foi realizado o transplante de medula óssea entre animais Ifi204-/- e WT. Após 21 dias do transplante, a periodontite foi induzida em ambos os grupos experimentais pelo modelo de ligadura. Decorridos 9 dias, foi realizada citometria de fluxo da medula óssea utilizando o CD45 como um marcador hematopoiético para determinar o sucesso do transplante. A perda óssea alveolar foi medida pela análise de µCT. Os dados foram analisados pelo teste \"t\" usando o software GraphPad Prism 7.0a (a=5%). Trinta dias após o transplante, a eficiência de reconstituição encontrada foi de cerca de 80% com base no CD45.1/2. Camundongos com as células transplantadas do animal Ifi204-/-, não mostraram diferença significativa de perda óssea média em comparação com camundongos com as células transferidas de animal WT [0,35mm (DP=0,058mm) vs. 0,43mm (DP=0,104mm) respectivamente, p>0,05]. Assim, o transplante de medula óssea demonstrou que a origem das células que expressam IFI16 durante a progressão da periodontite não são de origem hematopoiética. O segundo objetivo desse estudo foi avaliar, por meio de imunohistoquímica, a participação da IFI16 e IFN-α/β na gênese e no desenvolvimento da lesão periapical induzida em dentes de camundongos. De um total de 45 camundongos C57BL/6, foi realizada a indução da lesão periapical nos primeiros molares inferiores em 40 animais divididos nos períodos experimentais de 2, 7, 14, 21 e 42 dias. Oito animais de cada período experimental e 5 animais do grupo controle foram eutanasiados e os espécimes submetidos ao processamento histotécnico para imunomarcação para a descrição da presença/ausência e localização da IFI16 e IFN-α/β (análise qualitativa). Após análise dos resultados, concluiu-se que a IFI16 e os IFN-α/β participaram da progressão da lesão periapical induzida experimentalmente em dentes de camundongos. Paralelamente, os macrófagos são células fagocíticas, conhecidas por apresentarem uma considerável heterogeneidade em termos morfológicos, funcionais e expressão de marcadores. Dependendo do microambiente ao qual os monócitos, suas células progenitoras, estão expostos, há a definição do seu fenótipo em \"classicamente ativado\" (M1) ou \"alternativamente ativado\" (M2). Os macrófagos M1 promovem um ambiente altamente microbicida e têm papel na mediação da destruição de patógenos e células tumorais. Já os macrófagos M2 desempenham um papel central nas respostas frente às infestações parasitárias, remodelação tecidual, angiogênese e doenças alérgicas. Assim, o terceiro objetivo desse trabalho foi a caracterização fenotípica de macrófagos M1 e M2 no desenvolvimento da lesão periapical induzida em dentes de camundongos. Um total de 130 camundongos C57BL/6 foram divididos em grupos controle (dentes hígidos; n=50 animais) e experimental (dentes com lesão periapical experimentalmente induzida; n=80 animais). Decorridos os períodos de 2, 7, 14, 21 e 42 dias, animais controles e experimentais foram eutanasiados e os espécimes submetidos ao processamento histotécnico, para a descrição das características dos tecidos apicais e periapicais em cortes corados com HE, sob microscopia convencional. Além dissa, sob microscopia de fluorescência foi realizada a morfometria para medir a área das lesões periapicais. Foi realizado, também, o qRT-PCR para análise de expressão gênica de Cxcl10, CxCL9, iNos2, Arg1, Ym1, Fizz1 e MRC1 e ensaio Luminex®, para a marcadores de macrófagos M1 e M2 (GM-CSF, IFN-g, IL-4, IL-13, IL- 10, IL-6, IL-1β e TNF-α). Para os dados da morfometria realizou-se o teste ANOVA, seguido pelo pósteste de Tukey. Para os valores obtidos de qRT-PCR e Luminex®, realizou-se o teste de Kruskal-Wallis seguido do pós-teste de Dunn. Todos os dados foram analisados usando o software GraphPad Prism 7.0a (a=5%). Os resultados permitiram concluir que no decorrer dos períodos, a lesão periapical progrediu. Além disso, com base nos resultados de expressão gênica e quantificação das citocinas, observou-se que a progressão da lesão periapical ocorreu de maneira dinâmica. Além disso, houve predomínio do fenótipo M1 nos períodos iniciais da lesão periapical, passando pela tentativa de reparo com o fenótipo M2 aos 14 e 21 dias e voltando ao fenótipo M1 quando a lesão está estabelecida e é caracterizada como crônica. Por fim, o quarto objetivo desse estudo foi avaliar a capacidade de diferentes materiais utilizados no tratamento endodôntico de dentes portadores de necrose pulpar e lesão periapical em modular o fenótipo de macrófagos M1 e M2. Em cultura de células de macrófagos derivados da medula óssea de animais, foi realizada a análise da expressão gênica de marcadores de macrófagos M1 e M2 por meio do qRT-PCR (Cxcl10, CxCL9, iNos2, Arg1 , Ym1, Fizz1 e MRC1) e quantificação de citocinas pelo Luminex® (GM-CSF, IFN-γ, IL-4, IL-13, IL- 10, IL-6, IL-1β e TNF-α), após exposição aos cinco cimentos endodônticos AH PlusTM, Sealapex XpressTM, EndosequenceTM, BioRootTM, EndomethasoneTM e a pasta Calen®. Para os valores normais utilizou-se ANOVA, seguido pelo pós-teste de Tukey. Para os valores não normais, utilizou-se o teste de Kruskall-Wallis. Todos os dados foram analisados usando o software GraphPad Prism 7.0a (α=5%). Conclui-se que os materiais avaliados foram capazes de induzir a produção de citocinas pró e anti-inflamatórias, além de estimularem um padrão misto de macrófagos (M1/M2).