Produção de interferon-alfa consenso recombinante em Escherichia coli:avaliação de estratégias para obtenção da proteína solúvel.

• Ano de defesa: 2021
• Autor(a) principal: Grabarz, Felipe
• Tipo de documento: Tese
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP
• Palavras-chave em Português: Antiviral; Arbovirus; Arbovírus; Biofármaco; Biopharmaceutical; E. coli; Interferon
• Link de acesso: https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/87/87131/tde-25112022-103052/

A indústria de biofármacos cresceu de forma acelerada nos últimos anos e seus produtos são utilizados como tratamento de diversas doenças. A citocina interferon- tem sido amplamente utilizada devido às suas propriedades antivirais e antineoplásicas, principalmente na manifestação do vírus da Hepatite C. Desenvolveu-se uma molécula recombinante não natural, o recombinant interferon consenso (cIFN), projetada após a análise da sequência de aminoácidos dos diversos subtipos de IFN-, gerando uma molécula consenso. Este trabalho visa desenvolver Bioprocessos para produção e purificação do cIFN em E. coli utilizando diversas estratégias para obtenção da proteína em forma solúvel e ativa. Inicialmente, a fusão proteica de cIFN com Fh8 e DsbC foi testada. Três proteínas de fusão com cIFN foram construídas em laboratório: HF-IFN (tag Fh8 fusionada ao cIFN); HD-IFN (tag DsbC fusionado ao cIFN) e o H-IFN (cIFN fusionada apenas com His-tag e sem tag de solubilidade). Os resultados obtidos, indicam que a presença da tag Fh8 (HF-IFN) aumenta a produção da proteína alvo na fração solúvel e favorece a manutenção desta condição quando comparada a construção sem a tag (H-IFN). Ademais, a recuperação de cIFN derivada da construção HD-IFN foi inferior ao HF-IFN e, também, foi detectada a presença de diversos contaminantes que impediram o uso posterior da molécula. Assim, os experimentos com HF-IFN foram priorizados. Os parâmetros usados nos cultivos celulares também exerceram efeito sobre a solubilidade proteica. BL21(DE3) transformadas com o plasmídeo pET28a-HF-IFN foram cultivadas a 37 °C e induzidas com 1 mM de IPTG, o HF-IFN se concentrou majoritariamente na fração insolúvel. A diminuição da temperatura de 37 °C para 30 °C e a redução da concentração de IPTG de 1 mM para 0,1 mM usada na indução favoreceu o acúmulo na fração solúvel. Os resultados também sugerem que quanto maior o tempo de cultivo, maior é a tendência de a proteína tornar-se insolúvel. A produção também foi testada em outros três meios de cultura que não possuem proteína de origem animal: meio de cultura de autoindução e outros dois meios de cultura quimicamente definidos SDAB e HDF. O cultivo feito com a cepa BL21(DE3) transformada com o plasmídeo pET28a-HF-IFN em meio de autoindução a 30 °C teve maior rendimento de proteína alvo na fração solúvel quando comparado aos outros dois. Após a purificação da fusão HF-IFN por Q-Sepharose e IMAC-Ni2+, a retirada da tag Fh8 foi realizada por hidrólise enzimática mediada por TEV, graças ao sítio de clivagem inserido entre a tag Fh8 e o cIFN. A separação de cIFN foi realizada em nova IMAC-Ni+2. Os resultados obtidos demonstram que o cIFN recombinante foi obtido com 100% de pureza. Além disso, o cIFN exerceu forte atividade antiviral utilizando baixas concentrações da molécula produzida. Assim, a molécula foi capaz de inibir o efeito citopático de Arbovirus e também SARS-CoV-2 após a infecção em células VERO in vitro. Análise por dicroísmo circular de cIFN mostra que a estrutura secundária foi gerada como esperado. Assim, esta pesquisa visa contribuir com a geração de conhecimento aplicado na área da biotecnologia farmacêutica.