Validação da técnica de sequenciamento massivo paralelo para detecção de variantes no gene smn1 causadoras da atrofia muscular espinhal

• Ano de defesa: 2024
• Autor(a) principal: Brasil, Carolina Serpa
• Orientador(a): Saute, Jonas Alex Morales
• Tipo de documento: Dissertação
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Palavras-chave em Português: Atrofia muscular espinal; Diagnóstico; Estudo de validação; Sequenciamento de nucleotídeos em larga escala; Triagem neonatal
• Palavras-chave em Inglês: Spinal muscular atrophy; Diagnostic method; Massive parallel sequencing; Neonatal screening
• Link de acesso: http://hdl.handle.net/10183/277124

Introdução: A atrofia muscular espinhal (AME) é caracterizada por fraqueza muscular progressiva decorrente da degeneração dos motoneurônios do corno anterior da medula espinhal, sendo a segunda doença autossômica recessiva fatal mais comum . Pela possibilidade de ser classificada em tipos, o diagnóstico de AME precisa ser uma avaliação dos sinais clínicos associados à análise molecular. A técnica molecular usualmente utilizada para detecção da variante patogênica comum no gene SMN1 é o Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (MLPA). Entretanto esta técnica não apresenta um bom custo benefício, devido ao tempo despendido para execução quando utilizada em larga escala em populações de baixo risco. Outros grupos de pesquisa já estão pesquisando sobre a técnica de sequenciamento massivo paralelo (SMP) como uma metodologia de triagem, pois além de identificar doentes e portadores, esta técnica permite a inclusão de outros genes no mesmo ensaio, sendo promissora no contexto de triagem molecular de doenças genéticas e na busca por modificadores moleculares de fenótipo da doença. Objetivo: Validar o SMP para identificação de variantes patogênicas no SMN1 , tanto grandes deleções quanto variações de nucleotídeos únicos e pequenas inserções. Métodos: Realização de estudo de acurácia diagnóstica do SMP de painel contendo os genes SMN1 e SMN2 e os genes controle (potencialmente modificadores do fenótipo) NCALD e PLS3 pela plataforma Ion Torrent (S5), em pacientes com genótipo previamente definido por MLPA, divididos entre os grupos homozigotos para deleção comum no SMN1 , portadores (heterozigotos) e homozigotos normais. Resultados: O estudo de acurácia foi realizado em 49 das 50 amostras (8 homozigotos para deleção comum, 20 heterozigotos e 21 homozigotos normais). A discriminação entre casos com AME (zero cópias de SMN1 ), e não afetados, portadores (1 cópia SMN1 ) e controles (2 cópias SMN1 ) foi possível através da normalização de profundidade de leituras com gene controle NCALD . A acurácia (área sob a curva, AUC) para diferenciação entre casos e portadores foi de 1.0 (IC95% 1.0 a 1.0, p<0.001), para diferenciação entre casos e controles foi de 1.0 (IC95% 1.0 a 1.0, p<0.001) e para a diferenciação entre portadores e controles foi de 0.864 (IC95% 0.74 a 0.989, p<0.001). A acurácia para quantificação do número de cópias do gene SMN2 não foi estatisticamente significativa, exceto na diferenciação de sujeitos com 0 e 4 cópias do SMN2 em relação àqueles com 1, 2 ou 3 cópias deste gene. O painel também foi capaz de identificar a variante p.Gln154* no S MN1/SMN2 em dois nos pacientes com heterozigose composta e a variante modificadora c.859G>C no SMN2 foi coberta pelo painel. Conclusão: O painel de SMP contendo amplicons específicos do SMN1 e SMN2 e apenas utilizando 1 gene normalizador foi capaz de diferenciar com acurácia de 100% indivíduos homozigotos para a deleção comum do SMN1 (afetados), de indivíduos portadores e controles. A acurácia para diferenciação entre portadores e controles bem como para quantificação do número de cópias do SMN2 não foi considerada adequada. Desta forma, o estudo realizou a validação de um painel de SMP como exame de triagem diagnóstica para AME com custo muito inferior aos testes com SMP disponíveis atualmente (que utilizam centenas de genes controles) que poderá ser uma ferramenta de menor custo útil no contexto de programas de triagem neonatal. Entretanto este teste não parece ser adequado como exame de confirmação diagnóstica por não diferenciar satisfatoriamente casos e portadores.