Desenvolvimento de protocolo para criopreservação de folículos ovarianos de peixes usando vitrificação

• Ano de defesa: 2012
• Autor(a) principal: Godoy, Leandro Cesar de
• Orientador(a): Streit Júnior, Danilo Pedro
• Tipo de documento: Tese
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Palavras-chave em Português: Produção animal; Piscicultura; Gameta; Peixe; Genoma
• Palavras-chave em Inglês: Fish gamete; Maternal genome; Cryobanking; Mitochondria
• Link de acesso: http://hdl.handle.net/10183/60959

A criopreservação de embriões de peixes vem sendo investigada há mais de duas décadas, no entanto todos os protocolos testados até o momento falharam. A utilização de oócitos, mais recentemente, foi relatada como uma alternativa, no entanto, a maioria dos estudos foram realizados utilizando uma única técnica - o congelamento lento controlado - não alcançando nenhum êxito. A vitrificação é um método de criopreservação livre de gelo, apresentando diversas vantagens que podem contribuir para superar algumas das dificuldades relacionadas com a criopreservação de oócitos de peixes. No presente estudo desenvolveu-se um protocolo de vitrificação para folículos ovarianos de zebrafish em estádio III. Uma série de crio-soluções foram formuladas e testadas quanto à sua capacidade de vitrificação empregando diferentes dispositivos (palheta plástica, bloco de vitrificação e fibreplugTM). A toxicidade das soluções de vitrificação foi avaliada através da análise de integridade da membrana dos folículos ovarianos utilizando coloração com trypan blue. Além disso, foi investigado o efeito do protocolo de vitrificação sobre os folículos em nível sub-celular, através da medição da concentração de ATP citoplasmático e da distribuição e atividade mitocondrial, utilizando sonda fluorescente JC-1 e microscopia confocal. Após a vitrificação, os folículos ovarianos apresentaram integridade de membrana de 59,9 ± 18,4% quando o fibreplug e a solução V16 (1.5 M metanol + 4.5 M propileno glicol) foram empregados. Quando vitrificados em V2 (1.5 M metanol + 5.5 M DMSO) a integridade de membrana diminuiu para 42,0 ± 21,0%. Observou-se que os folículos localizados no meio do fragmento foram mais protegidos de injúrias apresentando satisfatória aparência quanto a sua morfologia mesmo 2 h após o aquecimento. A integridade mitocondrial das células da camada da granulosa foi claramente prejudicada pelo protocolo de vitrificação e o nível de ATP nos folículos diminuiu significativamente (P < 0,05) após o aquecimento. A vitrificação de folículos ovarianos de zebrafish em estádio III e seu efeito em nível de subcelular são relatados aqui pela primeira vez. As informações obtidas a partir deste estudo serão muito úteis para guiar o desenvolvimento e otimização de um protocolo para a criopreservação de oócitos de peixes no futuro.