Produção de insumos simplificados baseados em bactérias recombinantes para uso em reações de amplificação de ácidos nucleicos

• Ano de defesa: 2022
• Autor(a) principal: Ribeiro, Magno Sinval Pereira
• Orientador(a): Monteiro, Karina Mariante
• Tipo de documento: Dissertação
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Palavras-chave em Português: Escherichia coli; Produção de enzimas; Recombinacao genetica
• Link de acesso: http://hdl.handle.net/10183/263735

A expressão de proteínas recombinantes em Escherichia coli é vantajosa e viável devido a fácil manipulação genética, rápido crescimento, baixo custo e alta eficiência. Com os avanços da biotecnologia e a elevada demanda de ensaios moleculares de amplificação de ácidos nucleicos, como PCR e LAMP, a busca e competitividade por insumos proteicos fica evidente no mercado clinico e científico. Proteínas como as DNA-polimerases Taq e Bst e a transcriptase reversa MMLV-RT fazem parte da rotina de laboratórios moleculares. A produção simplificada baseada em bactérias recombinantes desses insumos apresentam vantagens como produção facilitada, baixo custo, alto rendimento e estabilidade a temperatura ambiente. Desta forma, objetivou-se produzir Taq, Bst e MMLV RT baseado em bactérias recombinantes para uso direto como células e extratos celulares em PCR e LAMP. Inicialmente, linhagens de E. coli foram transformadas com os respectivos plasmídeos das proteínas de interesse, seguida da padronização da expressão recombinante. Alíquotas das células expressando a Taq e a MMLV-RT foram utilizadas em PCR, qPCR e RT-PCR, e o extrato celular recombinante expressando a Bst foi utilizado no ensaio LAMP, ambas em substituição ao seu equivalente comercialmente disponível. Avaliamos a sensibilidade, especificidade e estabilidade das enzimas, as quais foram estáveis a temperatura ambiente e amplificaram o DNA molde, porém, nos ensaios de PCR e qPCR, efeitos negativos foram encontrados em ensaios com maior quantidade de células e menor concentração de DNA. No LAMP, foram obtidos bons resultados de amplificação utilizando o extrato celular da Bst recombinante. Em vista disso, a metodologia proposta é viável e acessível, sendo necessários mais estudos da aplicação dessa abordagem em ensaios moleculares.