Decifrando os mecanismos moleculares de teratogênese da talidomida : genética, embriologia e biologia de sistemas

• Ano de defesa: 2019
• Autor(a) principal: Kowalski, Thayne Woycinck
• Orientador(a): Vianna, Fernanda Sales Luiz
• Tipo de documento: Tese
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Palavras-chave em Português: Talidomida; Teratogênese; Embriologia
• Link de acesso: http://hdl.handle.net/10183/198842

A exposição à talidomida no início da gestação levou ao nascimento de milhares de crianças com um conjunto de malformações que foi depois denominado de Embriopatia da Talidomida (TE). Dois aspectos principais que permanecem não elucidados a respeito da teratogênese da talidomida são (1) a susceptibilidade à TE, uma vez que 20-50% dos embriões expostos à talidomida desenvolveram a embriopatia, e (2) a variabilidade interespecífica da TE. Assim, o objetivo dessa tese foi utilizar diferentes abordagens para entender os mecanismos moleculares de teratogenicidade da talidomida em humanos e nos principais modelos animais disponíveis, focando em susceptibilidade genética e de variabilidade fenotípica da TE. Duas variantes regulatórias no gene NOS3, que codifica a proteína eNOS, apresentaram-se em maior frequência em indivíduos com a TE, quando comparados a brasileiros da população geral, sem anomalias congênitas. Essas variantes estão associadas a menor expressão de NOS3, sugerindo-se um efeito pré-transcricional. A análise de polimorfismos foi expandida para outros genes da via de angiogênese, NOS2, PTGS2 e VEGFA, no entanto nenhum efeito de susceptibilidade foi encontrado. Uma revisão de literatura e avaliação de redes de interação proteína-proteína indicou duas proteínas centrais na ação antiangiogênica da talidomida: beta-catenina e eNOS. Outra abordagem visou sequenciar a região de CRBN que codifica a porção de ligação de Cereblon a talidomida. Não foram identificadas variantes exônicas, porém, foram identificadas variantes raras em maior frequência nos afetados pela TE do que nos controles sem anomalias congênitas. Uma associação entre rs1620675, polimorfismo no intron 10, e a presença de anomalias neurológicas foi identificada. Além de CRBN, a análise foi expandida, adicionando-se DDB1 e CUL4A, genes do complexo E3-ubiquitina-ligase (CRL4CRBN) e suas proteínas-alvo, IKZF1 e IKZF3. Após sequenciar esses genes em 35 afetados pela TE, foram encontradas 145 variantes entre os cinco genes, sendo mais de 90% delas em regiões regulatórias. Para entender o impacto dessas variantes, um score de impacto deletério foi desenvolvido e aplicado após predição funcional in silico. 12 Indivíduos com anomalias de membros de padrão pré-axial longitudinal possuíam score mais alto do que os afetados com focomelia. A partir de análise de dados secundários, foi avaliada a expressão gênica diferencial; em células-tronco embrionárias de camundongos a expressão de Crbn, Cul4a e Ddb1 encontrava-se reduzida. Uma experiência de aprendizado em embriologia experimental também foi desenvolvida no presente estudo. Ensaios de exposição com apremilast, análogo anti-inflamatório da talidomida, e diclofenaco foram realizados em embriões de galinha. Não foram encontradas anomalias nos embriões, porém alta taxa de letalidade foi visualizada em altas doses. Ainda em embriões de galinha, tentou-se induzir a TE sem o uso de talidomida, a partir da inserção de esferas nos vasos sanguíneos (tentativa de mimetizar o efeito anti-angiogênico) e pela retirada de porções da crista ectodérmica apical dos brotos dos membros desses embriões. Apesar de pequenas anomalias terem sido visualizadas, a capacidade regenerativa dos membros era alta. Foi então avaliado o padrão de conservação das proteínas afetadas pela talidomida em espécies que desenvolvem a TE versus espécies resistentes à embriopatia típica (ratos e camundongos). O gene CYP2C19, de metabolização, apresenta variação no número de cópias entre as espécies. Também, foram identificadas duas variantes exclusivas dos ratos e camundongos, uma no gene GSTP1 e outra em RECQL4. O último é uma helicase associada à Síndrome de Baller-Gerold, uma condição genética autossômica recessiva caracterizada por malformações de membros similares à TE, sua fenocópia. Ainda, encontrou-se uma correlação entre Recql4 e Crbn em células-tronco embrionárias de camundongos; essa correlação é fortemente alterada na exposição à talidomida. A fim de integrar todas as hipóteses da teratogênese da talidomida, usou-se de ferramentas de biologia de sistemas. Foi identificado que a β-catenina, proteína importante no desenvolvimento de membros, interconecta os principais mecanismos. Avaliando a expressão gênica diferencial a partir de dados secundários, encontrou-se enriquecimento das ontologias gênicas: “ciclo celular”, “replicação de DNA” e “reparo de DNA”. Desses genes com expressão reduzida, destaca-se ESCO2 e SHISA3. Mutações em ESCO2 levam a Síndrome de Roberts, 13 outra condição genética da qual a TE é uma fenocópia. SHISA3 é responsável pela degradação de β-catenina. Por fim, uma análise de passeio aleatório demonstrou que o gene codificante de β-catenina (CTNNB1) e SHISA3 são os mais próximos funcionalmente da susceptibilidade à talidomida. A partir dos resultados dessa tese, surgem novas vertentes de pesquisa para a compreensão da teratogênese da Talidomida, como os mecanismos compartilhados entre TE e as síndromes genéticas (fenocópias), e o papel central da β-catenina na TE. Ambos merecem ser analisados experimentalmente para que possam fornecer maiores evidências. Ainda assim, esse é o primeiro estudo a gerar uma hipótese integradora entre os diferentes mecanismos de teratogênese da talidomida, quem vem sendo discutidos ao longo de quase 60 anos. As perspectivas geradas a partir desse trabalho podem contribuir significativamente no esforço pela obtenção de uma alternativa segura à talidomida e para uso de biomarcadores no uso terapêutico da molécula.