Generation of T. cruzi strains knock-out for IP6K and evaluation of the resulting phenotypes

• Ano de defesa: 2023
• Autor(a) principal: Abuchery, Bryan Etindi
• Tipo de documento: Dissertação
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: eng
• Instituição de defesa: Universidade Estadual Paulista (Unesp)
• Palavras-chave em Português: CRISPR/Cas9; Pirofosfatos de inositol; Pirofosforilação; Trypanosoma cruzi; Chagas, Doença de; Proteína 9 Associada à CRISPR; Fosfatos de Inositol; Fenótipo; Inositol pyrophosphates; Pyrophosphorylation
• Link de acesso: http://hdl.handle.net/11449/244612

A doença de Chagas é uma doença tropical negligenciada causada pelo parasita protozoário Trypanosoma cruzi. Não existem vacinas eficazes e as opções de tratamento disponíveis são eficazes apenas na fase aguda da doença, mas podem causar efeitos colaterais graves nos pacientes. Assim, a busca pela elucidação de vias moleculares que possam fornecer potenciais alvos para o desenvolvimento de fármacos é de suma importância. Pirofosfatos de inositol (PP-IPs) – principalmente IP7 e IP8 – estão envolvidos em uma ampla gama de processos em eucariotos. No entanto, o mecanismo de ação desses metabólitos ainda não é totalmente compreendido. IP7 e IP8 são sintetizados por vias envolvendo a participação de IP6K e PP-IP5K quinases, respectivamente. Os tripanossomatídeos possuem um gene ortólogo para IP6K, mas não possuem ortólogos para PP-IP5K, tornando-os excelentes modelos para estudar IP7. Aqui, usando a abordagem CRISPR/Cas9, interrompemos alelos simples e duplos de IP6K, gerando linhagens IP6K-/+ e IP6K-/-, respectivamente. A inativação do IP6K causa vários efeitos morfológicos, como arredondamento e enrugamento do corpo celular, aumento do número de glicossomos e aumento mitocondrial. Notavelmente, a linhagem IP6K-/- (duplo nulo) foi incapaz de proliferar por mais de 7 dias, sugerindo que esta quinase é essencial para este organismo. Curiosamente, a linhagem IP6K-/+ (single-null) mostrou uma leve parada do ciclo celular na fase G0/G1 sem nenhum dano ao DNA (células quiescentes). Além disso, a linhagem IP6K-/+ mostrou uma alta capacidade proliferativa dentro da célula hospedeira de mamífero, sugerindo que as células quiescentes observadas podem ser formas metacíclicas. Juntos, nossos resultados sugerem que a perda total de IP6K tem consequências prejudiciais para o T. cruzi. No entanto, paradoxalmente, o rompimento de um único alelo do IP6K faz com que o T. cruzi fique propenso a se multiplicar ainda mais dentro da célula hospedeira, gerando um enigma que ainda estamos tentando entender.