Poderiam os pirofosfatos de inositol terem influenciado o desenvolvimento do parasitismo dentro dos cinetoplastídeos?

• Ano de defesa: 2023
• Autor(a) principal: Passos, Arthur de Oliveira [UNESP]
• Tipo de documento: Dissertação
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Universidade Estadual Paulista (Unesp)
• Palavras-chave em Português: Parasitismo; Tripanosomatídeos; Inositol pirofosfatos; Proteínas de quinases; Leishmania; Fosfatos de inositol
• Link de acesso: http://hdl.handle.net/11449/242809

Em eucariotos modelo, pirofosfatos de inositol (PP-IPs) – principalmente os chamados IP7 e IP8 – estão envolvidos em uma ampla gama de processos celulares, como regulação do comprimento dos telômeros, morte celular programada, recombinação homóloga (HR), entre outros. No entanto, o mecanismo de ação e o envolvimento destes metabólitos em outras vias espécie-específicas ainda são questões abertas. IP7 e IP8 são sintetizados através de vias complementares que envolvem a participação das quinases IP6K e PP-IP5K. Tripanosomatídeos parasitas (e.g., Leishmania spp. e Trypanosoma spp.) possuem um gene ortólogo para IP6K, mas aparentemente não possuem ortólogos para PP-IP5K, i.e., não sintetizam IP8, o que os torna excelentes modelos para o estudo de IP7. Além disso, estudos preliminares apontam que IP8 está presente em organismos de vida livre da classe Kinetoplastea. Assim, esta dissertação consistiu inicialmente em investigar se a presença de IP8 é mutuamente exclusiva em relação ao parasitismo dentro dos cinetoplastídeos. Para isso, realizamos análises evolutivas para confirmar a suposta perda da PP-IP5K em tripanosomatídeos. Reconstruímos árvores filogenéticas e obtivemos evidências robustas que confirmam a ausência de PP-IP5K em todos os tripanosomatídeos, exceto Paratrypanosoma confusum. As previsões das estruturas terciárias apontam que o domínio catalítico da PP-IP5K de P. confusum é naturalmente desestruturado, o que coloca em xeque sua função. Além disso, realizamos ensaios de dinâmica molecular com a PP-IP5K de Bodo saltans (BsPP-IP5K) e IP7, que é utilizado como substrato (junto com cofator ATP) para síntese de IP8. Nossas simulações sugerem que o BsPP-IP5K é totalmente capaz de sintetizar IP8. Dessa forma, amplificamos o gene BsPP-IP5K e adicionamos a ele as regiões 3' e 5' UTR da Gliceraldeído 3-Fosfato Desidrogenase (GAPDH). Posteriormente, clonamos essa construção no vetor pSP72-αHYGα (Marc Ouellette lab), gerando um plasmídeo que fornece expressão constitutiva epissomal de BsPP-IP5K em Leishmania spp. (episomal knock-in). Paralelamente, realizamos mutagênese sítio-dirigida para confirmar os resíduos de aminoácidos essenciais de BsPP-IP5K. A construção contendo a BsPP-IP5K mutada foi usada como controle nos ensaios knock-in. Com a inserção das construções em Leishmania braziliensis, realizamos a caracterização fenotípica das linhagens geradas, no qual, aparentemente, a presença da BsPP-IP5K não altera a proliferação e o ciclo celular. Futuramente, essas linhagens knock-in para PP-IP5-K serão utilizadas em ensaios de infecção para verificação da virulência e patogenicidade. Nossos achados até o momento sugerem que a transição de um estilo de vida livre para um estilo de vida parasitário resultou na perda de PP-IP5K. Os resultados deste trabalho poderão contribuir para a elucidação de novas rotas para o desenvolvimento de terapias antiparasitárias.