Padronização de ELISA para detecção de anticorpos anti-Toxoplasma gondii e Neospora caninum em soro e fezes de cervídeos

• Ano de defesa: 2021
• Autor(a) principal: Baldini, Maria Helena Mazzoni [UNESP]
• Tipo de documento: Tese
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Universidade Estadual Paulista (Unesp)
• Palavras-chave em Português: Patologia Veterinária; Toxoplasmose; Neospora; Transmissão; Animais silvestres
• Link de acesso: http://hdl.handle.net/11449/215815

A maior parte dos dados descritos na literatura sobre patógenos de cervídeos neotropicais são provenientes de levantamentos sorológicos, informações sobre vías de transmissão e avaliações clínicas ainda são escasos. O presente trabalho teve como objetivos: a) estimar a prevalência de cervídeos positivos para Toxoplasma gondii e Neospora canium em 92 animais mantidos em cativeiro; b) Avaliar a probabilidade de diferentes vias de transmissão do T. gondii e N. caninum; c) avaliar a sintomatologia clínica e resposta imune humoral de machos de veados-catingueiros (Mazama gouazoubira) infectados experimentalmente com oocistos da cepa ME49 (genotipo tipo II) de T. gondii e d) padronizar a técnica de ELISA indireta para detecção de anticorpos fecais específicos para T. gondii e N. caninum. Inicialmente, foram colhidas amostras dos animais cervídeos pertencentes a dois criadouro conservacionistas e comparados os resultados sorológicos obtidos nos testes de imunofluorescência indireta (RIFI) e ELISA indireto pelo teste de concordância Kappa de Cohen. Em seguida, foram desenhadas árvores genealógicas dos animais de cada espécie para estimativa da taxa de transmissão congênita de cada doença. A prevalência estimada para T. gondii foi de 20,73% pela tecnica de RIFI e 25,60% por ELISA, apresenando uma concordância rasoável (ϰ = 0,277) entre as duas técnicas sorológicas utilizadas. Já para N. caninum a prevalência estimada foi de 40,24% por RIFI e 39,02% por ELISA com uma correlação quase perfeita (ϰ = 0,83) entre as técnicas. A taxa de transmissão congênita, estimada com base em números de filhos positivos de mães positivas entre o número total de filhos de mães positivas, diferiu bastante entre as doenças, sendo de 0% para toxoplasmose e 81,25% para neosporose. No capítulo 3, para a infecção experimental dos animais, quatro machos da espécie Mazama gouazoubira foram infectados experimentalmente com 5000 oocistos esporulados de T. gondii da cepa ME49, enquanto um animal soronegativo foi usado como controle. Os animais foram monitorados quanto aos parâmetros clínicos de -7 a 40 dias após a infecção (dpi). Amostras de sangue foram coletadas semanalmente até 49 dpi para detecção de anticorpos pelo teste de ELISA. A cada 15 dias os animais foram submetidos à contenção química e coleta de sêmen por eletroejaculação e o material genético das amostras de semen foi extraído para posterior análise por PCR para T. gondii. Apenas dois dos quatro animais infectados desenvolveram resposta de anticorpos detectável no teste de ELISA, e mesmo sem nenhum animal ter manifestado sinais clínicos da infecção, o material genético do parasita foi encontrado no sêmen dos animais soropositivos aos 35 e 49 dpi. A terceira etapa do projeto visou a padronização da técnica de ELISA para detecção de imunoglobulinas fecais contra os dois patógenos. Amostras de fezes frescas foram coletadas, extraídas e armazenadas em nitrogênio líquido ou processadas imediatamente. Um pool de amostras de animais soropositivos foi utilizado como controle positivo para N. caninum e um pool de amostras de animais experimentalmente infectados foi usado como controle para T. gondii. Mesmo com diversas alterações de protocolos não foi possível contornar o problema da baixa especificidade do teste, constatada pelos altos ruídos nas leituras das placas. Foi possível concluir que as técnicas sorológicas provaram ser muito úteis para estudos epidemiológicos em animais de cativeiro, tendo diversas aplicações além da simples estimativa da prevalência, porém sem a padronização de um método não invasivo de detecção de anticorpos, estudos epidemiológicos em populações de vida-livre ainda são um grande desafio. Nesses estudos foi possível inferir que a principal via de transmissão do N. caninum em cervídeos é a via congênita, de forma semelhante ao que se observa em bovinos , enquanto que o T. gondii parece utilizar da via horizontal para a transmissão na maioria dos casos. Além disso , a infecção experimental com 5000 oocistos esporulados de T. gondii não causou sinais clínicos nos animais estudados, sugerindo que a espécie apresenta certa resistência à doença, por outro lado, a detecção do DNA do parasito no sêmen dos animais sugere que a transmissão sexual é uma possibilidade nessas espécies, o que deve ser levado em consideração por criadouros conservacionistas.