Ciclotídeos de Noisettia orchidiflora e Anchietea pyrifolia: isolamento, caracterização e avaliação de atividades biológicas

• Ano de defesa: 2020
• Autor(a) principal: Bobey, Antonio Fernández
• Tipo de documento: Tese
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Universidade Estadual Paulista (Unesp)
• Palavras-chave em Português: Ciclotídeos; Apis mellifera; Violaceae; Atividade inseticida; Atividade hemolítica; Sequenciamento de novo; Noisettia orchidiflora; Anchietea pyrifolia
• Link de acesso: http://hdl.handle.net/11449/193205

Ciclotídeos são peptídeos cíclicos de fonte vegetal biossintetizados via ribossomal, apresentam massa molecular entre 2,8-3,7 kDa, contendo seis resíduos de cisteína conservados e envolvidos na formação de um arranjo único conhecido como nó de cistina cíclico (cyclic cystine knot, CCK). Esse arranjo é responsável por sua estabilidade térmica, química e enzimática. Diversas atividades biológicas foram relatadas para esta classe de peptídeos, incluindo propriedades inseticidas, anti-helmínticas e moluscicidas, sugerindo que sua função biológica está relacionada à defesa de plantas. Até o momento, essas substâncias foram identificadas em cinco famílias vegetais: Violaceae, Rubiaceae, Cucurbitaceae, Solanaceae e Fabaceae. Neste trabalho foram realizados o isolamento, caracterização e avaliação das atividades biológicas dos ciclotídeos presentes em duas espécies vegetais da família Violaceae: Anchietea pyrifolia e Noisettia orchidiflora. Após o processo de extração dos constituintes químicos, foi realizada uma pré-purificação por meio de cromatografia em coluna com octadecilsilano, como fase estacionária, permitindo a obtenção das frações peptídicas de cada espécie. Estas frações enriquecidas foram analisadas por meio da técnica LC-ESI-IT-MS confirmando a presença de peptídeos na faixa de massa de 2,8-3,7 kDa e a análise dos resultados permitiu a anotação de 35 ciclotídeos na espécie N. orchidiflora e 48 na A. pyrifolia. Este resultado motivou o isolamento por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência de cinco substâncias da espécie A. pyrifolia (1-5) e quatro da N. orchidiflora (6-9). O sequenciamento de novo foi realizado por digestão enzimática com endoproteinase Glu-C, tripsina e quimiotripsina, seguido por análise de MALDI-TOF/TOF-MS. Os espectros foram cuidadosamente examinados e as sequências foram propostas, com base na presença das séries de íons b e y (fragmentos N e C-terminais); desta forma foi possível determinar a sequência dos ciclotídeos cyO4 (1), cyO17 (2), apy A (3), apy B (4), cter 15 (5), nor E (6), nor F (7), nor G (8) e vhr1 (9). Experimentos in vivo de injeção abdominal sobre a abelha africanizada Apis mellifera indicaram atividade inseticida para as substâncias 1 e 3. O nível de toxicidade destes ciclotídeos foi calculado de acordo com a análise dose-resposta pelo método Probit e expresso como concentração letal media (CL50), sendo suas CL50 de 76 e 262 μM, respectivamente. Citotoxicidade dos ciclotídeos 1, 2, 3 e 4 também foi avaliada em eritrócitos humanos. Apy A (3) apresentou dose hemolítica média (DH50) de 22 μM, enquanto que 1, 2 e 4 apresentaram baixa atividade na máxima concentração testada, com DH50 > 156 μM.