Síntese e caracterização de nanopartículas bioresponsivas para liberação de RNA de interferência: estudo in vitro do silenciamento de TNF-a

• Ano de defesa: 2019
• Autor(a) principal: Martinez Junior, André Miguel
• Tipo de documento: Dissertação
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Universidade Estadual Paulista (Unesp)
• Palavras-chave em Português: Quitosana; siRNA; Poliplexos; Terapia gênica; Vetor não viral; Chitosan; Polyplexes; Gene therapy; Non-viral vector
• Link de acesso: http://hdl.handle.net/11449/182072

O desenvolvimento tecnológico na síntese de ácidos nucleicos, possibilitou a obtenção de siRNAs com alta especificidade, aumentando o potencial de aplicação dessas moléculas na terapia gênica não viral. Contudo, a preparação de carreadores seguros e eficientes para entrega de siRNA é, ainda, um desafio que tem limitado suas aplicações terapêuticas. Neste estudo, foram sintetizados policátions multifuncionais baseados em quitosana para serem aplicados como carreadores na terapia gênica não viral. Policátions com diferentes massas moleculares e proporções crescentes de diisopropiletilamina (DIPEA), dietilaminoetil (DEAE) e polietilenoglicol (PEG) foram sintetizados e caracterizados. Os graus de substituição por DIPEA (5 – 55%), DEAE (15 – 57%) e PEG (1,8 – 2,5%) foram determinados por RMN 1H e RMN 13C. Modificações regiosseletivas na hidroxila (C-6) da quitosana foram realizadas por meio da proteção dos grupos amina com anidrido ftálico, seguida pela substituição (DIPEA) e desbloqueio com hidróxido de sódio. O grau de ionização dos diferentes policátions foi estudado em função do pH e os resultados mostraram que a carga superficial pode ser controlada por alterações na composição dos polímeros. Os derivados apresentaram capacidade de tamponamento superiores às quitosanas não modificadas. As nanopartículas foram preparadas por simples complexação e apresentaram diâmetro hidrodinâmico entre 100 e 200 nm, com potencial zeta positivo a partir da razão de amino/fosfato (N/P) 3. O potencial zeta mostrou-se dependente do conteúdo de DIPEA e PEG nos polímeros, bem como da razão N/P. O estudo de eletroforese indicou que os derivados de quitosana interagem fortemente com o siRNA, sob baixas razões N/P. A estabilidade coloidal e biológica das nanopartículas sob condições fisiológicas (pH 7,4 e força iônica de 150 mmol L-1) foi melhorada por meio do ajuste do grau de substituição (DIPEA e PEG), e nanopartículas com 200 nm permaneceram estáveis até 24 horas após sua preparação, e em até 7 horas na presença da albumina sérica bovina (BSA). A microscopia eletrônica de varredura mostrou nanopartículas com morfologia esférica. Estudos de citotoxicidade mostraram viabilidade celular superior a 70% para todos os polímeros e superior a 75% para os todos os poliplexos até a razão N/P 10. A microscopia confocal e os estudos de transfecção in vitro por meio do silenciamento de TNF- em macrófagos RAW 264.7, mostraram internalização eficiente do siRNA e um bloqueio de até 60% na expressão de TNF-. Em geral os resultados apresentados, indicam que esses derivados são vetores promissores para transfecção in vivo.