Estudo por dinâmica molecular e ressonância magnética nuclear de Viroporinas: análise da estrutura e do mecanismo de portão da proteína SH (HRSV) e da proteína M2 (vírus Influenza)

• Ano de defesa: 2018
• Autor(a) principal: Araujo, Gabriela Campos de
• Tipo de documento: Tese
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Universidade Estadual Paulista (Unesp)
• Palavras-chave em Português: RMN; NMR; Viroporinas; Proteína SH; Proteína M2; Dinâmica molecular; SH protein; M2 protein; Viroporin; Dynamics simulation
• Link de acesso: http://hdl.handle.net/11449/153124

As proteínas SH do HRSV e M2 do IAV são membros das viroporinas, uma família de proteínas virais pequenas de membrana. A proteína SH tem 64 resíduos de aminoácidos e uma estrutura pentamérica composta por alfa-hélice transmembranar. A proteína M2 tem 97 resíduos e forma uma estrutura tetramérica tambem composta por alfa-hélice. A função mais importante destas proteínas é a condução de prótons que é facilitada por um poro aquoso que atravessa quase completamente a membrana. O conjunto de resíduos de W41 da M2 atua como um portão, restringindo o transporte de prótons para o interior viral. Estudos recentes de ressonância magnética nuclear de estado sólido (ssNMR) mostraram que as cadeias laterais do W41 têm uma amplitude de movimento muito limitadas. No entanto, detalhes do mecanismo de portão do W41 dependentes de pH ainda não foram esclarecidos. Nossos estudos recentes sobre a proteína SH do HhSV mostraram que o pentâmero tem duas conformações, uma aberta e outra fechada. No entanto, para a elucidação do mecanismo da proteína SH, HRSV e hospedeiro durante a infecção viral, mais detalhes de sua estrutura e função são necessários. Neste estudo, descrevemos e comparamos as características estruturais da proteína SH completa e do seu peptídeo transmembranar (TM) em diferentes estados de protonação das histidinas (H22 e H51) para fornecer informações detalhadas sobre o arranjo conformacional desses dois sistemas em diferentes ambientes (POPC, DMPC, domínios de raft e TFE / água) usando simulação de dinâmica molecular. Para a proteína M2, a fim de proporcionar uma reavaliação estrutural dos resíduos W41 e fornecer informações detalhadas sobre o rearranjo conformacional destes aminoácidos durante a condução de próton, os marcadores isotópicos de M2 foram realizados por expressão em Escherichia. coli; a proteína expressa foi purificada, reconstruída nas bicamadas DOPC:DOPE (4:1) e incorporada nos lipossomas. A análise do arranjo estrutural dos quatro resíduos W41 e a sua caracterização conformacional em pHs 5,8, 6,2 e 7,3 foram avaliadas usando ssNMR. Com os resultados obtidos, analisamos o comportamento da disposição dos resíduos de W41 durante a condução de prótons contribuindo para a compreensão deste mecanismo de portão W41. Resultados de interação proteína-bicamada mostram que o domínio TM é suficiente para interação e inserção da proteína SH, sugerindo um mecanismo livre de inserção. A análise do comprimento completo da SH e do peptídeo TM mostrou uma inclinação diferente em diferentes composições de bicamadas lipídicas, sugerindo interações entre os aminoácidos do N e C-terminal com a superfície da bicamada e influência da composição lipídica para o endereçamento dessa proteína na bicamada. A interação com a interface raft e não-raft, que também ocorre com a proteína M2, sugere um papel da SH na montagem e brotação viral. Diferentes composições lipídicas influenciam a estrutura do pentâmero da proteína SH e do peptídeo TM, assim como observado com a estrutura monomérica, mas a presença do poro aquoso não foi observado mesmo a protonações representando diferentes valores de pHs. Simulações na presença de desbalanço de carga mostraram uma propensão do peptídeo TM a formação do poro aquoso quando histidinas 22 estão protonadas e sob aplicação de uma potencial positivo. Com todos esses resultados, podemos mostrar a importância desta classe de proteínas na infecção viral e o estudo de sua estrutura encoraja a busca de novos alvos no combate a infecção viral por combinação de ferramentas experimentais e teóricas.