Estudo biofísico da interação do domínio N terminal da nucleoproteína do vírus sincicial respiratório humano com flavonoides por espectroscopia de fluorescência e ressonância magnética nuclear

Detalhes bibliográficos
Ano de defesa: 2020
Autor(a) principal: Sá, Jéssica Maróstica
Orientador(a): Não Informado pela instituição
Banca de defesa: Não Informado pela instituição
Tipo de documento: Dissertação
Tipo de acesso: Acesso aberto
Idioma: por
Instituição de defesa: Universidade Estadual Paulista (Unesp)
Programa de Pós-Graduação: Não Informado pela instituição
Departamento: Não Informado pela instituição
País: Não Informado pela instituição
Palavras-chave em Português:
RMN
Link de acesso: http://hdl.handle.net/11449/191826
Resumo: O Vírus Sincicial Respiratório humano (hRSV) é um dos principais causadores de doenças respiratórias agudas como bronquiolite e pneumonia em crianças e idosos. Atualmente, as patologias causadas pelo hRSV não são bem entendidas e os resultados de desenvolvimento de vacinas não são satisfatórios. Dentre as proteínas codificadas por esse vírus, a nucleoproteína N é importante na proteção do RNA viral formando o nucleocapsídeo (NC) e por sua atuação como molde para a replicação e transcrição pelo complexo da polimerase viral. O reconhecimento eficiente e específico do NC pela polimerase é mediado pela fosfoproteína P. Isso deve-se à interação de resíduos do Cterminal da proteína P em um bolso hidrofóbico no domínio N-terminal da proteína N (N-NTD). O presente estudo consiste em uma caracterização biofísica da proteína recombinante N-NTD e uma investigação da ligação de flavonoides ao bolso hidrofóbico no N-NTD utilizando abordagens experimentais e computacionais. Os espectros de dicroísmo circular (CD) mostraram que o N-NTD é composto majoritariamente de estruturas em -hélice e seu processo de desenovelamento térmico é caracterizado por uma temperatura de melting ( ) de 44,2 ± 0,3 °C e variação de entalpia de van’t Hoff de desnaturação ( ) de 620 ± 52 kJ·mol-1. Os resultados de calorimetria de varredura diferencial para a temperatura de desenovelamento estão de acordo com os dados de CD, indicando uma de 43,16 ± 0,05 °C. A variação de entalpia calorimétrica ( ) de 213,9 ± 0,6 kJ·mol-1 calculada para a desnaturação térmica do N-NTD indica que o processo não é reversível e há a formação de agregados, uma vez que . Os experimentos de diferença de transferência de saturação por ressonância magnética nuclear (STD-RMN) indicaram uma ligação específica e seletiva da hesperetina ao N-NTD visto que outros flavonoides testados não apresentaram interação com o domínio. O mapeamento dos epítopos de ligação da hesperetina sugere que seu anel benzeno conjugado com o anel heterocíclico encontra-se mais interiorizado no sítio de ligação do domínio NNTD. Os experimentos de deslocamento via STD-RMN do dipeptídeo C-terminal (Asp-Phe) da proteína P pela hesperetina sugerem que esse flavonoide liga-se ao bolso hidrofóbico da proteína N. Os experimentos de competição por anisotropia de fluorescência corroboram com os dados de deslocamento via STD-RMN e também indicam que a hesperetina compete pelo bolso hidrofóbico no N-NTD. Os dados de simulação computacional sugerem um modo de ligação compatível com as analises experimentais, mostrando que a hesperetina interage no bolso hidrofóbico do N-NTD, com uma orientação semelhante a ligação do dipeptídeo. Em conclusão, os resultados sugerem que a hesperetina liga-se ao bolso hidrofóbico no sítio de interação nucleoproteína/fosfoproteína do hRSV, caracterizando esse composto polifenólico como um potencial candidato à ação antiviral que inibiria o processo de replicação viral, o que poderia proporcionar o desenvolvimento de uma nova estratégia de combate ao vírus.