Padronização de metodologia diagnóstica para fusões cromossomais : uma análise comparativa entre reação em cadeia de polimerase em tempo real e sequenciamento de nova geração para detecção simultânea das principais fusões na leucemia mieloide aguda

• Ano de defesa: 2024
• Autor(a) principal: Vieira, Andressa Folha
• Tipo de documento: Dissertação
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Palavras-chave em Português: Leucemia mielóide aguda (LMA); Diagnóstico molecular; Validação; Fusão
• Link de acesso: http://repositorio.unb.br/handle/10482/51705

A medula óssea é a principal produtora de células hematopoiéticas, e sua disfunção pode levar ao desenvolvimento de leucemia, caracterizada pela proliferação anormal de célulastronco pluripotentes que não amadurecem adequadamente. A Leucemia Mieloide Aguda (LMA) é uma forma específica dessa doença e seu diagnóstico exige uma abordagem multifacetada que inclui imunofenotipagem, análise citogenética convencional e testes genéticos moleculares. A triagem para rearranjos gênicos é crucial para confirmar o diagnóstico e ajustar a terapia, impactando de modo significativo o prognóstico. Nesse contexto, o objetivo desse estudo foi de desenvolver método de reação de polimerase em cadeia em tempo real com transcrição reversa (RT-PCR) para detectar fusões gênicas observadas na LMA. Para isso, foi extraído RNA de amostras de medula óssea ou sangue periférico de voluntários com LMA, RTPCR em tempo real e sequenciamento de nova geração (NGS). A RT-PCR foi padronizada com uma etapa inicial de 45°C por 10 minutos, seguida por ativação a 95°C por 5 minutos, e ciclos de extensão e anelamento a 95°C por 5 segundos e 65°C por 30 segundos. O NGS foi utilizado para validar os resultados obtidos pela RT-PCR em tempo real. Comparações entre os métodos foram realizadas para determinar a acurácia da RT-PCR, e foram determinadas ainda sua precisão, sensibilidade e especificidade. Foram incluídos 11 pacientes com diagnósticos de LMA. A RT-PCR em tempo real apresentou acurácia de 100%, quando comparada ao NGS, para a deteção das fusões BCR-ABL P210, CBFB-MYH11, KMT2A-MLLT1, PMR-RARA, ABL1, KMT2A-MLLT10, BCR-ABL P190, RUNX-RUNX1T1 e KMT2A-MLLT3. Por meio de testes in sílico e da curva de dissociação dos produtos de amplificação, foi observada a especificidade da RT-PCR em tempo real. A sensibilidade da RT-PCR em tempo real variou de 192,4 a 1531,9 cópias por reação, dependendo do alvo (fusão gênica). Dessa forma, observou-se que a RT-PCR em tempo real demonstrou ser uma alternativa ao NGS para a deteção de fusões gênicas observadas na LMA e investigadas rotineiramente em sua abordagem diagnóstica e terapêutica. Considerando o custo e disponibilidade do NGS, o a RT-PCR pode representar uma alternativa de menor custo e maior celeridade no fornecimento de resultados de fusões gênicas investigadas no manejo de pacientes com LMA.