Construção de cassete para a co-supressão do gene da oleoil dessaturase e transformação genética de embriões somáticos de soja

• Ano de defesa: 2005
• Autor(a) principal: Lima, Andreia Barcelos Passos
• Tipo de documento: Tese
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Universidade Federal de Viçosa
• Palavras-chave em Português: Biotecnologia; Soja - melhoramento genético; Transformação genética; Embriogênese somática; Regulação de expressão gênica; Ácidos graxos Ômega-6; Ciências Agrárias
• Link de acesso: http://www.locus.ufv.br/handle/123456789/10551

A introdução de características agronomicamente importantes em soja pode ser realizada por transformação genética de plantas como um método alternativo ao melhoramento tradicional. Alterações nas proporções relativas dos ácidos graxos na fração óleo podem ser alcançadas por meio do silenciamento gênico de enzimas dessaturases, responsáveis pela síntese de ácidos graxos polinsaturados. Os objetivos deste trabalho foram: isolar um fragmento do gene da oleoil dessaturase de soja, construir cassete de expressão para a co-supressão deste gene e estabelecer metodologias para a extração e quantificação de ácidos graxos de embriões somáticos. A análise por RT-PCR mostrou que o gene Fad2-1 é expresso em todos os estádios de desenvolvimento da semente. A expressão desse gene aumentou a partir dos estádios iniciais de desenvolvimento e diminuiu em sementes maduras. Um fragmento de cDNA de cerca de 1 kb foi clonado nos vetores binários pCAMBIA 3301 e 1304, cujos T- DNAs apresentam genes para resistência a herbicida e antibiótico, respectivamente. A clonagem foi confirmada por meio de PCR, restrição enzimática e seqüenciamento. A construção clonada no vetor pCAMBIA 3301 foi utilizada para a transformação de soja via Agrobacterium. Embriões somáticos foram originados a partir de cotilédones imaturos cultivados na presença de 40 mg/L de 2,4-D. Agregados de embriões globulares foram transformados com suspensão bacteriana mediante sonicação e adição de acetoseringona e mantidos em meio seletivo com 3 mg/L e 5 mg/L do herbicida Finale → . A maioria dos embriões germinou normalmente em meio sem regulador de crescimento, embora alguns não tenham sido capazes de regenerar plantas. Apenas cinco plantas foram aclimatadas em casa de vegetação, mas não eram transgênicas. As análises moleculares com plântulas e/ou embriões somáticos cotiledonares permitiram a detecção de vários eventos de transformação. O conteúdo de ácidos graxos dos diferentes estádios de desenvolvimento embrionário foi determinado por cromatografia gasosa. Foram observadas mudanças na composição de ácidos graxos no estádio globular, com aumento dos conteúdos de ácido oléico (18:1) e linoléico (18:2) e diminuição de ácido linolênico (18:3). A partir do estádio torpedo, a composição de ácidos graxos não variou significativamente até o final do desenvolvimento, apresentando resultados similares aos de sementes maduras. A análise por RT-PCR mostrou um aumento no acúmulo de transcritos do gene Fad2-1 do estádio globular para torpedo. A expressão desse gene permaneceu relativamente constante até o estádio cotiledonar maduro, com redução da expressão após o processo de dessecação. Os dados quanto aos perfis de ácidos graxos de 138 embriões cotiledonares transformados foram analisados por meio de estatística descritiva para verificar a freqüência dos diferentes eventos de transformação. Oitenta e quatro embriões apresentaram conteúdo de 18:1 semelhante ao controle não transformado (13-21%), 18 apresentaram níveis inferiores (9-13%) e 36 apresentaram níveis aumentados (22-61%), provavelmente como possível conseqüência de silenciamento gênico. Em relação ao conteúdo de 18:2, 88 embriões apresentaram conteúdo semelhante ao controle não transformado (49-59%), 17 apresentaram níveis superiores (59-64%) e 33 apresentaram níveis inferiores de 18:2 (6-49%). Em 101 embriões o conteúdo de 18:3 foi semelhante ao controle não transformado (8-15%), 30 mostraram níveis superiores (15-27%) e 7 mostraram níveis inferiores (4-8%). Os resultados mostraram a existência de modificação na composição de ácidos graxos nos embriões cotiledonares analisados, mas não se pode afirmar que essas alterações sejam causadas por fenômenos de silenciamento gênico. Estes resultados podem ter sofrido a influência de variações somaclonais ou da auxina 2,4-D.