Avaliação do potencial embriogênico de cultivares de soja e transformação com o gene citrato sintase

• Ano de defesa: 2002
• Autor(a) principal: Gesteira, Abelmon da Silva
• Tipo de documento: Tese
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Universidade Federal de Viçosa
• Palavras-chave em Português: Soja; Citrato; Embriogênese somática; Transformação genética; Tolerância ao alumínio; Ciências Agrárias
• Link de acesso: http://www.locus.ufv.br/handle/123456789/11201

Avaliou-se o potencial genético de nove cultivares de soja em relação à embriogênese somática utilizando 2,4-D como agente indutor a fim de selecionar os genótipos mais responsivos para serem transformados com o gene que codifica a citrato sintase (CS). Foi verificado um efeito marcante do genótipo nas respostas morfogênicas. Os cultivares Spring, CAC-1 e COODETEC 201 apresentaram as melhores respostas, com médias de produções de embriões por cotilédone de 32,63, 27,60 e 26,80, respectivamente. Cinco cultivares foram utilizados na fase de proliferação. Destes, os cultivares CAC-1 e Spring apresentaram altas freqüências de formação de agregados de embriões secundários, 90,6% e 91,6%, respectivamente. Para avaliar a fidelidade genética das plantas regeneradas por este sistema embriogênico foram utilizados marcadores RAPD. Vinte “primers” foram usados para avaliar 44 regenerantes do cultivar Spring e 28 do cultivar CAC-1. Três “primers” apresentaram bandas polimórficas para dois regenerantes do cultivar Spring, em relação à planta matriz, com uma freqüência de variação somaclonal de 4,5%. Para ‘CAC-1’, quatro “primers” mostraram polimorfismos em um regenerante, com freqüência de variação de 3,5%. Estes resultados mostram que marcadores RAPD podem ser utilizados para assegurar a estabilidade genética de plantas regeneradas via sistema de embriogênese somática em soja, garantindo a fidelidade genética dos regenerantes. A taxa de variação somaclonal, avaliada em nível molecular, foi relativamente baixa para as plantas regeneradas (menor que 5%) quando comparado às relatadas para outras espécies. Portanto, o protocolo de embriogênese somática com 180 μM de 2,4-D foi usado para obter plantas de soja geneticamente modificadas com o gene CS. Após seleção dos cultivares mais responsivos à embriogênese, seguiu-se a transformação genética. Cotilédones dos cultivares Spring e CAC-1 foram utilizados para avaliar o nível de expressão transitória em resposta à transformação mediada por Agrobacterium com o auxílio da sonicação. O tempo de sonicação foi de 2 segundos e os cotilédones foram co-cultivados em meio MSD40 suplementados e não-suplementado com acetossiringona (100 μM). A freqüência relativa da expressão transitória de gene GUS, na face adaxial dos cotilédones, foi de 13,9% e 19,3% para os cultivares CAC-1 e Spring, respectivamente, quando acetossiringona foi empregado. Porém, na ausência de acetossiringona, a freqüência relativa reduziu para 0,37% e 1,46% para CAC-1 e Spring, respectivamente. A avaliação da expressão transitória na otimização de sistemas de transformação serviu como suporte para transformação com o gene CS. Agregados de embriões do cultivar CAC-1 foram transformados com o gene (CS) de Daucus carota e de Escherichia coli. Um total de 26 embriões transformados com o gene CS de D. carota e 31 com o gene CS de E. coli chegaram à fase final para conversão em plantas. Quando colocados no meio de conversão e germinação o processo de conversão foi iniciado com a emissão dos primeiros folíolos. No entanto, logo em seguida iniciava um forte processo de necrose dos folíolos com conseqüente morte das plântulas. Sugere-se que o efeito necrótico observado nos folíolos das plântulas transgênicas poderia estar associado ao nível de expressão do gene CS. Uma superexpressão desse gene levaria ao acúmulo de citrato nas folhas, inibindo a respiração o que acarretaria acúmulo de piruvato. Piruvato em excesso na folha é utilizado na síntese de lactato, causando elevação na acidez. Este fato promoveria a necrose observada nos folíolos das plântulas de soja transformadas com o transgene CS.