Utilização de Kluyveromyces lactis na expressão da GDPase de Leishmania major.

• Ano de defesa: 2009
• Autor(a) principal: Santos, Yaro Luciolo dos
• Tipo de documento: Dissertação
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Universidade Federal de Viçosa; BR; Associações micorrízicas; Bactérias láticas e probióticos; Biologia molecular de fungos de interesse; Mestrado em Microbiologia Agrícola; UFV
• Palavras-chave em Português: GDPase; Kluyveromyces lactis; Apirase; Leishmania major; Leishmaniose; Leishmaniasis; CNPQ::CIENCIAS BIOLOGICAS::FISIOLOGIA
• Link de acesso: http://locus.ufv.br/handle/123456789/5312

A levedura Kluyveromyces lactis apresenta potencial aplicabilidade biotecnológica como hospedeira na produção heteróloga de proteínas recombinantes de interesse biotecnológico. Neste contexto o objetivo deste trabalho foi expressar a proteína GDPase de Leishmania major em K. lactis para fins biotecnológicos aplicados às leishmanioses humana e canina. A GDPase de L. major pertence à família das E-NTPDases ou apirases, proteínas envolvidas na infectividade e virulência de parasitos. A técnica da Reação da Polimerase em Cadeia (PCR) foi utilizada para amplificar uma seqüência de 2073 pb referente a região codificante completa da GDPase de L. major, sendo este amplicon inserido no plasmídeo pKLAC1 nos sítios Sal I e Bgl II. A construção pKLAC1-GDPase foi confirmada por PCR, linearizada pela enzima Ahd I e utilizada para transformação da cepa selvagem de K. lactis CBS 2359. Os transformantes foram selecionados em meio YCB contendo 5 mM de acetamida e cultivados sob condições de indução em batelada em meio YPGal. Extrato e sobrenadante destas culturas foram analisados por SDS-PAGE e Western Blot utilizando um anti-soro policlonal anti-GDPase de L. major. As análises revelaram uma única proteína de cerca de 120 kDa nas cepas selvagem e transformantes de K. lactis. Pesquisa no Genbank revelou a presença de dois genes homólogos a GDPase no genoma da levedura: KlGDA1 e KlYND1que podem explicar a reatividade cruzada. Os resultados demonstram que os transformantes obtidos não produzem a GDPase de L. major, provavelmente devido a não reconstituição do promotor PLAC4 que dirigiria a expressão do gene da GDPase. Porém levanta as hipóteses de que a cepa selvagem possa ser testada quanto à indução da produção de anticorpos contra espécies do gênero Leishmania e de sinalizar que o sistema utilizado contém falhas que comprometem seu uso, devido à dependência de reconstituição do promotor PLAC4.