Célula hospedeira ura3 para a produção de proteínas recombinantes em Kluyveromyces lactis

• Ano de defesa: 2001
• Autor(a) principal: Medina, Pilar Ximena Lizarazo
• Tipo de documento: Dissertação
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Universidade Federal de Viçosa
• Palavras-chave em Português: Kluyveromyces lactis; Ciências Biológicas
• Link de acesso: http://www.locus.ufv.br/handle/123456789/11335

Foi isolado um mutante auxotrófico para uracila de Kluyveromyces lactis com potencial para ser hospedeiro em sistemas de expressão heteróloga de proteínas recombinantes. Uma população selvagem de K. lactis foi irradiada com luz ultravioleta e selecionada na presença de ácido 5 fluoro orótico (5FOA). Dez colônias auxotróficas para uracila e resistentes a 5FOA foram selecionadas. Todas cresceram em meio utilizando lactose como única fonte de carbono e exibiram atividade de β galactosidase normal em relação à célula selvagem. Os mutantes apresentaram velocidades específicas de crescimento inferiores a da célula selvagem em soro de queijo ultrafiltrado (SUF), o que indicou ser o soro de queijo um meio limitante em uracila, afetando o crescimento dos mutantes. O mutante M7 foi selecionado por apresentar uma freqüência de reversão baixa (1,7 x 10 -10 ). A complementação da auxotrofia na linhagem M7 mediante transformação com o plasmídeo PTG802 contendo o gene URA3 de S. cerevisiae foi analisada. Melhor eficiência de transformação de K. lactis foi obtida com o método de choque térmico com acetato de lítio, polietilenoglicol e DNA carreador fita simples. Um transformante mostrou viiiintegração do plasmídeo em um fragmento de 6,0 Kb. A velocidade de crescimento da célula mutante (0,04 h -1 ) em SUF foi inferior a da célula selvagem (0,26 h -1 ). Estes resultados sugerem que o SUF é limitante em uracila. Conseqüentemente a transformação dos mutantes, com o gene URA3, fisiologicamente causou aumento na velocidade especifica de crescimento (0,22-0,25h -1 ) quando cultivadas em SUF, atingindo os níveis da célula selvagem e evidenciando a complementação da auxotrofia.