Proteoma extracelular de Kluyveromyces lactis em cultura contínua sob limitação de nitrogênio

• Ano de defesa: 2008
• Autor(a) principal: Santos, Agenor Valadares
• Tipo de documento: Tese
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Universidade Federal de Viçosa; BR; Associações micorrízicas; Bactérias láticas e probióticos; Biologia molecular de fungos de interesse; Doutorado em Microbiologia Agrícola; UFV
• Palavras-chave em Português: Kluyveromyces lactis; Proteína extracelular; Proteoma; Extracellular protein; Proteome; CNPQ::CIENCIAS BIOLOGICAS::MICROBIOLOGIA::BIOLOGIA E FISIOLOGIA DOS MICROORGANISMOS
• Link de acesso: http://locus.ufv.br/handle/123456789/1532

A identificação de proteínas extracelulares de leveduras em cultura contínua pode oferecer informações sobre a influência do status nutricional na via de captura de nutrientes alternativos. Essa análise auxilia a otimização das condições necessárias para a produção dessas proteínas com o máximo rendimento, além de oferecer uma estratégia de construção de um sistema de expressão e secreção de proteínas em leveduras. Neste trabalho, mostra-se o perfil das proteínas extracelulares de culturas de Kluyveromyces lactis submetidas a estresse por nitrogênio. A técnica de cultivo em regime contínuo, aliada à análise proteômica, foi utilizada para investigar a resposta da cultura de K. lactis em duas velocidades de crescimento estabelecidas em função da concentração de nitrogênio, ou seja, 0,03 h-1 e 0,09 h-1. A velocidade de crescimento de 0,09 h-1 mostrou o maior rendimento na produção de proteínas extracelulares (1,54 mg.L-1), maior conversão de glicose em proteína (3,3 x 10-4 g.g-1) e um maior rendimento de biomassa (0,13 g.g-1). Através da análise dos perfis protéicos em SDS-PAGE gradiente de amostras dos extratos extracelulares nas duas velocidades de crescimento, pôde-se distinguir, inicialmente, diferenças no proteoma de culturas de K. lactis. A velocidade de 0,09 h-1 apresentou maior número de bandas quando comparada com o perfil obtido para 0,03 h-1. Na identificação proteômica das bandas excisadas do gel por espectrometria de massa em MALDI-TOF-TOF-MS, os espectros obtidos foram analisados utilizando-se o software MASCOT®. As proteínas sugeridas por essa análise estão relacionadas a processos de ciclo celular, replicação, transcrição, mudanças pós-traducionais, metabolismo de carboidrato, ubiquitinação e degradação celular e são comumente encontradas no interior celular. Os extratos extracelulares de K. lactis também foram analisados por cromatografia líquida bi-dimensional (LC-2D), na qual a velocidade específica de crescimento de 0,09 h-1 apresentou maior número de picos cromatográficos, resultado que indica a presença de maior número de proteínas nessa velocidade com relação a 0,03 h-1. Nas várias análises por espectrometria de massa em MALDI-TOF-TOF-MS, das amostras advindas da cromatografia líquida 2D, obteve-se um total de 95 massas moleculares nas duas velocidades específicas de crescimento; dessas massas, aproximadamente 30% pertencem às amostras da velocidade específica de crescimento de 0,03 h-1 e 70%, à velocidade específica de crescimento de 0,09 h-1. A análise por espectrometria de massa também evidenciou a presença de glicosilações (moléculas de N-acetilglicosamina e de 8 a 15 moléculas de hexose por proteína) e de outras possíveis mudanças pós- traducionais em amostras resultantes da LC-2D de ambas as velocidades específicas de crescimento. Na identificação das proteínas extracelulares, as amostras, obtidas na LC-2D das duas velocidades específicas de crescimento, foram tripsinolizadas e analisadas novamente por espectrometria de massa, e as proteínas sugeridas pela análise foram aquelas de K. lactis ligadas ao trânsito de peptídios e ao metabolismo de carboidrato, enzimas de transcrição e outras enzimas, como transferases, cinases, hidrolases, descarboxilases, oxidases e mutarotases, do mesmo modo que na avaliação anterior; e essas proteínas não obtiveram os scores mínimos para a identificação por homologia ser considerada estaticamente significativa.