Influência de antibióticos na morfogênese in vitro, transformação genética e isolamento de RNA de urucum (Bixa orellana L.)

• Ano de defesa: 2007
• Autor(a) principal: Rodrigues, Simone de Miranda
• Tipo de documento: Tese
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Universidade Federal de Viçosa; BR; Genética animal; Genética molecular e de microrganismos; Genética quantitativa; Genética vegetal; Me; Doutorado em Genética e Melhoramento; UFV
• Palavras-chave em Português: Urucum; Transformação genética; Bixina; Annatto; Genetic transformation; Bixa orellana; CNPQ::CIENCIAS BIOLOGICAS::GENETICA::GENETICA VEGETAL
• Link de acesso: http://locus.ufv.br/handle/123456789/1422

A introdução de genes envolvidos na via de biossíntese de bixina em Bixa orellana tem sido almejada, com o objetivo não somente de obter plantas que produzam alto conteúdo desse corante natural, mas principalmente, estudar a rota de biossíntese responsável pelo acúmulo desse carotenóide em sementes de urucum. Assim, a biotecnologia, por meio de técnicas de cultura de tecidos, é uma ferramenta alternativa para produzir plantas de urucum com alto conteúdo de bixina. Portanto, os objetivos deste trabalho foram estudar a influência de antibióticos na morfogênese in vitro e estabelecer um protocolo de transformação genética e isolamento de RNA para a espécie estudada. Avaliando o uso de higromicina na seleção de plantas transformadas de duas matrizes da variedade Bico de Pato ( M1 e M6 ) de urucum, cultivadas em meio MS contendo 4,56 μM de zeatina, observou-se que 4 mg L-1 desse antibiótico foi capaz de inibir 100 % da frequência regenerativa de brotos provenientes de hipocótilos não submetidos a pré-cultivo; enquanto que essa mesma concentração foi ineficaz para inibir a regeneração de brotos a partir de hipocótilos pré-cultivados por 3 dias. Para segmentos radiculares da variedade Peruana , 2,5 mg L-1 de higromicina foi capaz de reduzir 98 % das brotações. Também, não ocorreu regeneração de brotos em raízes cultivadas em meio contendo canamicina, sendo que 12,5 e 25 mg L-1 desse antibiótico resultaram no alongamento de raízes, com escurecimento dos explantes cultivados em meio contendo concentrações maiores que 50 mg L-1 de canamicina. O estudo realizado para verificar as respostas morfogênicas a partir de hipocótilos e raízes de duas variedades de urucum, influenciado pela adição, no meio de cultura, de antibióticos que atuam na eliminação de bactérias, indicou que a regeneração de brotos provenientes de hipocótilos foi mais eficiente na condição controle, visto os antibióticos avaliados promoverem a inibição da regeneração de brotos provenientes desses explantes; enquanto que para segmentos de raízes, foi observado diferença entre as médias das variedades Bico de Pato e Peruana , sendo que essa última apresentou os resultados mais baixos para todos os tratamentos avaliados. Esses resultados indicaram que a resposta morfogênica dos explantes de urucum é genótipo específico e dependente da fonte do explante utilizado. Um sistema eficiente de transformação genética via Agrobacterium rhizogenes R1601, carregando a construção quimérica nos-nptII-nos, foi adequado para explantes hipocotiledonares de urucum. Para os experimentos de transformação utilizaramse duas matrizes da variedade Bico de Pato , M2 e M6 , tendo sido verificado diferenças na intensidade de respostas entre essas matrizes. Condições de obtenção de brotos foram otimizadas, verificando-se que o uso de um período indutivo de 10 dias, em meio de cultivo líquido suplementado com 4,56 μM de zeatina, seguido de cultivo em meio semi-sólido, acelerou o calejamento e surgimento das raízes hairy root . Entretanto, menor quantidade de gemas foi observada, em tempo prolongado de cultivo, usando-se meio de cultura desprovido deste fitorregulador. Também, o protocolo utilizando MATAB a 2 % em solução salina 3 M foi eficiente para a extração de RNA de urucum, visto a dificuldade de isolamento de ácidos nucléicos para essa espécie vegetal, muito rica em polifenóis e polissacarídeos, o que favorecerá futuras análises envolvendo a introdução de genes de interesse agronômico.