Produção do domínio de ligação ao receptor do coronavírus da síndrome respiratória aguda grave 2 utilizando Komagataella phaffii

• Ano de defesa: 2024
• Autor(a) principal: Fernandes, Luciana de Souza
• Tipo de documento: Tese
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Universidade Federal de Viçosa; Biologia Celular e Estrutural
• Palavras-chave em Português: SARS-CoV-2; Receptores de coronavírus; COVID-19 (Doença) - Diagnóstico; Proteínas recombinantes; CIENCIAS BIOLOGICAS::MICROBIOLOGIA::BIOLOGIA E FISIOLOGIA DOS MICROORGANISMOS::VIROLOGIA
• Link de acesso: https://locus.ufv.br/handle/123456789/32711; https://doi.org/10.47328/ufvbbt.2024.451

O coronavírus da síndrome respiratória aguda grave 2 (SARS-CoV-2, espécie Betacoronavirus pandemicum) emergiu em dezembro de 2019 em Wuhan na China e rapidamente se espalhou pelo mundo, alcançando o status de pandemia em março de 2020. O vírus é transmitido pelo ar por meio de gotículas e aerossóis contaminados, afetando principalmente o trato respiratório. A proteína spike (S) está presente na superfície viral, sendo responsável pela ligação ao receptor humano enzima conversora de angiotensina 2 (ACE2) por meio de interação entre ACE2 e o domínio de ligação ao receptor (RBD). A proteína S e o domínio RBD tem sido extensamente empregados em diversas aplicações biotecnológicas. O desenvolvimento de tecnologias nacionais para o controle da pandemia é de extrema importância para o enfrentamento da pandemia e preparo para possíveis pandemias no futuro, de modo que a independência da importação de produtos implica numa resposta mais rápida em emergências de saúde pública. Visto que a produção de antígenos para testes diagnóstico e vacinas contribui para o encarecimento destes produtos, a utilização de leveduras para produção de proteínas recombinantes é uma alternativa atrativa para a produção de antígenos dada sua grande capacidade de expressão, bom custo-benefício e capacidade de escalonamento. Neste contexto, este trabalho descreveu a expressão de RBD das linhagens selvagem, Alfa, Beta e Gama de SARS-CoV-2 utilizando a levedura metilotrófica Komagataella phaffii. As proteínas recombinantes foram purificadas por cromatografia de afinidade. A imunodetecção foi realizada com anticorpo para cauda de polihistidinas, anti-Spike e pool de soros de IgG positivos para SARS-CoV-2. Ensaio de deglicosilação com a enzima PNGase F foi realizado para detecção de glicoformas da proteína. Além disso, a identidade das RBDs recombinantes foi confirmada por espectrometria de massas. IgG ELISA foi realizado para verificar a potencial aplicação das RBDs como antígenos de captura e sua capacidade de discriminação entre amostras soropositivas e soronegativas de COVID-19. Diferentes condições de ensaio foram empregadas para melhorar os parâmetros de sensibilidade e especificidade, que variaram de 65.22-73.91% e 58.33-75%, respectivamente. A melhor condição empregou as proteínas digeridas com a endoglicosidase PNGase F e adição de manose ao tampão de diluição dos soros. O resultado dos testes para as quatros variantes de RBD variaram de sensibilidade de 55-76.09% e especificidade de 59.57-74.47%. RBD da linhagem selvagem teve o melhor resultado, com sensibilidade de 76.09% e especificidade de 74.47%, valores moderados para um teste diagnóstico. Já as RBD recombinantes de Alfa, Beta e Gama obtiveram valores menores, refletindo baixo poder discriminatório entre soros IgG positivos e negativos. Os resultados obtidos indicam que a proteína RBD da linhagem selvagem possui potencial para detecção de anticorpos anti-RBD, porém mais testes de otimização são necessários para melhorar os parâmetros de sensibilidade e especificidade. Palavras-chave: SARS-CoV-2; Coronavírus; RBD; COVID-19; Ferramentas diagnósticas.