Desenvolvimento de modelo in vitro de superexpressão de ace2 e tmprss2 para estudo de infecção por Sars-Cov-2

• Ano de defesa: 2023
• Autor(a) principal: Bartolomeo, Cynthia Silva [UNIFESP]
• Tipo de documento: Dissertação
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Universidade Federal de São Paulo
• Palavras-chave em Português: COVID-19; SARS-CoV-2; ACE2; TMPRSS2; Superexpressão; Overexpression
• Link de acesso: https://repositorio.unifesp.br/handle/11600/67401

O SARS-CoV-2 (Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2), agente etiológico da COVID-19 (Coronavirus disease 2019), tornou-se uma grande preocupação mundial, principalmente devido aos impactos nos sistemas de saúde na maioria dos países e na vida das pessoas. A entrada do vírus na célula hospedeira ocorre após a ligação da proteína spike (S), presente na espícula viral, ao receptor celular ACE2 (ECA2 - enzima conversora de angiotensina 2). Após a ligação, o vírus precisa ganhar acesso ao citosol, processo esse dependente da clivagem proteolítica da proteína S pela serino protease tipo II (TMPRSS2). No presente projeto, após avaliação da cinética viral nas linhagens Vero-E6, HuH7, BEAS-2B, A549, HEK-293T e HUVEC verificamos a existência de dois perfis de replicação viral. Nomeamos como “high-viral profile” as linhagens Vero-E6 e HuH7 por terem demonstrado uma capacidade de replicação viral ao longo do tempo muito superior às linhagens BEAS-2B, A549, HEK-293T e HUVEC que foram classificadas como sendo “low-viral profile”. Determinamos a expressão gênica e proteica dos receptores ACE2 e TMPRSS2 nas linhagens acima mencionadas, bem como a atividade de ACE2, de maneira a estabelecer uma relação aos achados da cinética viral. O desenvolvimento de um modelo que permita estudos relacionados à COVID-19 é de extrema relevância clínica, acadêmica e terapêutica. Assim sendo, a partir da criação de modelos celulares in vitro de superexpressão de ACE2 e TMPRSS2, em linhagens reconhecidamente suscetíveis ao SARS-CoV-2, visamos elucidar a participação desses receptores nos mecanismos fisiopatológicos da COVID-19. Foram desenvolvidos dois modelos de estudo in vitro do SARS-CoV-2: 1) modelo de superexpressão de ACE2 via plasmideal e 2) modelo de superexpressão de ACE2, TMPRSS2 e co-expressão de ACE2 e TMPRSS2 através de um vetor lentiviral em linhagens BEAS-2B, A549, HUVEC, HEK-293T e HuH7. Após criação do modelo de superexpressão via plasmideal das linhagens BEAS-2B-ACE2 e A549-ACE2 verificamos uma maior cinética de replicação viral quando comparadas aos seus respectivos controles, demonstrando que uma maior expressão do receptor ACE2 é capaz de promover uma potencialização na infecção por SARS-CoV-2. Constamos uma maior atividade de ACE2 nas linhagens acima mencionadas, como também na HUVEC-ACE2. Sendo a proliferação diminuída em todas as linhagens criadas (BEAS-2B-ACE2, A549-ACE2, HEK-293T e HUVEC-ACE2). Em células BEAS-2B e HUVEC, a superexpressão de ACE2 aumentou a cinética de replicação viral, em contrapartida a superexpressão de TMPRSS2 não promoveu maior entrada viral. Em relação à variante Ômicron, observamos uma cinética de replicação viral superior ao vírus selvagem em linhagem BEAS-2B-ACE2, uma cinética intermediária em linhagem BEAS-2B-ACE2-TMPRSS2 e inferior em BEAS-TMPRSS2. Ademais, foi possível verificar que a Ang II aumenta a replicação do SARS-CoV-2 WT em células HUVEC, sendo esse aumento suprimido quando o receptor ACE2 é superexpresso. Modelos in vitro que mimetizem a superexpressão de ACE2 e TMPRSS2, em diferentes tipos celulares, são de grande utilidade para o estudo dos mecanismos de infecção viral e desenvolvimento de terapias, podendo auxiliar em futuros estudos para verificação de uma possível potencialização da infecção, simulando a sensibilização das células após a entrada viral. Desta forma, um maior entendimento do papel da ACE2 e TMPRSS2 na COVID-19, poderá agregar conhecimentos de novos alvos terapêuticos, uma melhor compreensão dos mecanismos de entrada do vírus e o comportamento das células frente à infecção.