Avaliação da expressão gênica e proteica dos receptores nicotínicos em modelo in vitro de infecção por SARS-CoV-2 com e sem superexpressão de ECA2

• Ano de defesa: 2023
• Autor(a) principal: Nunes, Tamires Alves [UNIFESP]
• Tipo de documento: Dissertação
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Universidade Federal de São Paulo
• Palavras-chave em Português: nAChRs; SARS-CoV-2; COVID-19; ECA2; ACE2
• Link de acesso: https://repositorio.unifesp.br/handle/11600/67371

Introdução: O SARS-CoV-2 (Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2) é o vírus causador da COVID-19 (Coronavírus disease 2019), doença decretada pandêmica em 2020. A entrada do vírus na célula hospedeira ocorre após a ligação da proteína Spike à ECA2 (Enzima Conversora de Angiotensina 2). A COVID-19 pode levar a uma série de complicações, tais como, inflamação pulmonar grave e aguda, sepse, lesão cardíaca aguda e tromboembolismo venoso. Neste sentido, os receptores nicotínicos da acetilcolina (nAChRs) podem estar relacionados à COVID- 19, não somente com a capacidade de invasão viral, uma vez que ele possa ter relação com a expressão de ECA2, mas sobretudo com o desencadeamento e/ou modulação do processo inflamatório agudo, podendo ser opção de alvo terapêutico. Sendo assim, esclarecer a relação do nAChR e da ECA2 em modelo in vitro de infecção por SARS-CoV-2 pode elucidar novos mecanismos. Nossa hipótese é que a superexpressão de ECA2 assim como a infecção pelo SARS-CoV-2 module os nAChRs em células pulmonares. Objetivo: O objetivo deste projeto foi avaliar uma possível interação de ECA2 com os nAChRs e se a ativação destes receptores modula a infecção por SARS-CoV-2. Material e Métodos: Para tanto, células BEAS-2B e A549 foram induzidas, de forma transiente (lipofecção) ou permanente (lentivírus), a superexpressar a ECA2 (ECA+). Nessas células, avaliou-se a expressão gênica de α3, α7 e β2nAChR por RT-qPCR e a expressão proteica de α7nAChR por Western Blotting. Além disso, as células com maior expressão de ECA2 (BEAS-2B lentivírus) e selvagens foram infectadas com MOI 0,2 de vírus SARS-CoV-2 e tratadas com nicotina (10μM e 100μM) e PNU-282987 (3μM, 10μM e 20μM) a fim de avaliar a carga viral. A entrada viral foi avaliada pela expressão gênica do gene N do SARS-CoV-2 por RT-qPCR. Por fim, avaliamos se a infecção por SARS-CoV-2 em células ECA2+ e selvagens modula a expressão dos α7nAChR. Resultados: Observou-se que a expressão gênica de receptores α7nAChR (p<0,0001), α3nAChR (p<0,0001) e β2nAChR (p<0,001) é maior em células BEAS-2B do que em células A549. A superexpressão permanente de ECA2 (maior que 1000 vezes) em BEAS-2B induz uma redução da expressão gênica de α7nAChR, α3nAChR e β2nAChR comparado a célula selvagem (p<0,05, para todas as comparações), entretanto, há um aumento da expressão proteica de α7nAChR nestas células (p<0,0001). O tratamento com nicotina (10μM) reduziu a carga viral em células BEAS-2B selvagem infectadas com SARS-CoV-2 (p<0,001) e este efeito não foi observado nas células BEAS-2B ECA2+. O PNU, um agonista seletivo do α7nAChR, não mostrou nenhum efeito no tratamento das células estudadas. A exposição de BEAS-2B selvagem ao SARS-CoV-2 induziu um aumento da expressão gênica de α7nAChR (p<0,05), todavia, não foi observado este efeito nas células BEAS-2B ECA2+. Conclusão: Estes dados sugerem que a infecção de SARS-CoV-2 aumenta a expressão gênica de α7nAChR em células BEAS-2B e que o estímulo dos nAChR reduz a carga viral em células infectadas, sugerindo um papel protetor dos nAChR nas células pulmonares infectadas. Ainda, mostramos que o aumento permanente de ECA2 reduz a expressão gênica dos nAChRs em células BEAS-2B, confirmado pela ausência de efeito da nicotina (agonista dos nAChRs) e do PNU (agonista do α7nAChR) na redução da carga viral nessas células. Considerando que o aumento da ECA2 está relacionado a um aumento da infecção viral, estes dados sugerem que o nAChR reduzido pode corroborar com o aumento da infecção. Esses dados em conjunto sugerem que os nAChRs possam ter uma participação na fisiopatologia da COVID-19, com possível efeito protetor. Ainda, uma relação entre nAChR e ECA2 pode ter relevância no entendimento da fisiopatologia de outras doenças.