Estudo da alfa amilase de Bacillus koreensis isolado de ecossistema aquático da Amazônia: clonagem molecular, expressão e caracterização

• Ano de defesa: 2018
• Autor(a) principal: Neves, Rogério de Oliveira
• Outros Autores: http://lattes.cnpq.br/3308129552342670
• Tipo de documento: Tese
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Universidade Federal do Amazonas; Instituto de Ciências Biológicas; Brasil; UFAM; Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia
• Palavras-chave em Português: Bacia Amazônica; Rio Negro; Rio Solimões; Rio Mamori; Vetor pDMU01; AMYKOR; CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
• Link de acesso: https://tede.ufam.edu.br/handle/tede/6674

A região amazônica possui uma imensa Biodiversidade de ecossistemas aquáticos do planeta e várias vias bioquímicas nestes ecossistemas aquáticos, atuando na reciclagem do carbono orgânico, tal como, a alfa amilase. Para isto, o objetivo deste trabalho foi isolar bactérias amilolíticas dos ecossistemas aquáticos da Amazônia, seleção de um bom produtor de alfa amilase, clonagem e expressão do gene da alfa amilase (Amy). Com o propósito de isolar as unidades formadoras de colônias (UFC’s) e identificar a atividade enzimática amilolítica qualitativa e quantitativa, além de, clonar o gene AMYKOR da alfa amilase e expressar em E. coli. A mostras de água foram coletadas nos rios Negro, Solimões e o Mamori, e posteriormente, foram identificados clones com a capacidade de hidrolisar amido. A seguir, foi extraído do DNA total das bactérias amilolíticas para amplificação dos genes de RNA Ribossomal 16 S e do gene de alfa-amilase para identificação taxonômica molecular. As análises das sequências mostraram ser Bacillus koreensis o isolado melhor produtor de alfaamilase. Subsequentemente, foi enviado para a síntese química a sequências do gene alfa amilase, que posteriormente, foi clonado e expresso em E. coli. O B. koreensis e o clone recombinante de E. coli produtores de alfa-amilase foram cultivados em 50 mL meio LB com agitação a 30ºC e 37ºC respectivamente. A células foram retiradas por centrifugação a baixa velocidade e as enzimas dos sobrenadantes precipitadas com etanol 50%, recuperandose um total de 106 unidades de alfa amilase (recombinante) e 120 unidades de alfa amilase selvagem de Bacillus koreensis). Os resultados da caracterização bioquímica mostraram que tanto a enzima natural como a recombinante apresentaram pH ótimo igual a 6 e temperatura ótima de 60 °C, para ambas as enzimas estudadas. Verificamos os parâmetros da cinética enzimática aparente de Km de 4,8 mg/mL e a velocidade máxima aparente de 2,6 mg-1 . mL- 1 . minuto-1 da alfa amilase recombinante, bem como, os parâmetros da cinética enzimática aparentes de Km aparente de 4,0 mg/mL e a velocidade máxima aparente de 2,3 mg-1 . mL-1 . minuto-1 da alfa amilase selvagem do Bacillus koreensis. Pode-se verificar que tanto a alfa amilase natural como a recombinante apresentaram temperaturas ótimas, pHs ótimos e parâmetros cinéticos similares. Esses parâmetros indicam que a enzima tem potencial para uso industrial.