Desenvolvimento de reação de qPCR para detecção de H. capsulatum em amostras de solo de grutas e cavernas do Município de Presidente Figueiredo

• Ano de defesa: 2021
• Autor(a) principal: Silva, Bianca Kelly Neves Izidro da
• Outros Autores: http://lattes.cnpq.br/6428127791753756
• Tipo de documento: Dissertação
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Universidade Federal do Amazonas; Faculdade de Ciências Farmacêuticas; Brasil; UFAM; Programa de Pós-graduação em Ciências Farmacêuticas
• Palavras-chave em Português: Biologia molecular; Fungos do solo; CIENCIAS BIOLOGICAS: GENETICA: GENETICA MOLECULAR E DE MICROORGANISMOS; Desenvolvimento; Grutas; Cavernas; qPCR; Histoplasma capsulatum
• Link de acesso: https://tede.ufam.edu.br/handle/tede/8303

Histoplasma capsulatum é um fungo encontrado no ambiente que causa uma micose profunda, que se apresenta de forma assintomática à disseminada. Na forma disseminada acomete principalmente pacientes com AIDS. Na América do Sul, essa enfermidade é uma das três principais que levam o paciente com AIDS a óbito. Apesar destes fatos poucos estudos avaliaram sua distribuição ambiental. Este estudo teve como objetivo o desenvolvimento de reação de qPCR para detecção de H. capsulatum em amostras de solo de grutas e cavernas do Município de Presidente Figueiredo. Inicialmente, foi feito um estudo in silico com software Geneious para desenvolver um primer da região ITS do DNAr de H. capsulatum, em seguida o conjunto de primers e sonda foi validado com a execução da curva padrão com DNA de cultura do fungo alvo, cálculo do erro experimental, teste para verificar reações cruzadas com outros patógenos e teste de sensibilidade e especificidade. Por fim, com estes primers e sonda foi feita a verificação da presença do H. capsulatum em 30 amostras de solo de 2 cavernas e 1 gruta do município de Presidente Figueiredo que tiveram seu DNA extraído por duas metodologias distintas. Como resultados, foi desenvolvido um conjunto de primers e sonda para detecção de H. capsulatum para uso em PCR em tempo real (qPCR) tendo como alvo a região ITS do DNAr. O desenho desenvolvido demonstrou in silico ser tão ou mais adequado que outras propostas que tinham como alvo esta mesma região. O conjunto demonstrou resultados satisfatórios quanto limite de detecção,10 fg/μL de amostra (20 fg/reação), curva padrão adequada (r2 0,97), baixo erro experimental, ausência de reação cruzada com outros organismos patogênicos sensibilidade e especificidade adequados. Os experimentos aplicando o novo conjunto de primers e sonda em 30 amostras de solo de grutas/cavernas do Município de Presidente Figueiredo demonstraram a presença de DNA de H. capsulatum em uma amostra. A proposta de qPCR é uma nova opção de detecção/diagnóstico que poderá ajudar no entendimento da distribuição ambiental do patógeno bem como no diagnóstico clínico em amostras biológicas. A detecção de H. capsulatum em amostra de solo de caverna do município de Presidente Figueiredo reforça a necessidade de cuidados recomendados para o turismo na região.