Otimização de ensaios moleculares para o diagnóstico da Covid-19

• Ano de defesa: 2022
• Autor(a) principal: Sousa, Karoline Almeida Felix de
• Orientador(a): Souza, Bruno Solano de Freitas
• Tipo de documento: Dissertação
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Link de acesso: https://www.arca.fiocruz.br/handle/icict/57508

INTRODUÇÃO: Para o controle da pandemia de SARS-CoV-2 a testagem em massa se revelou fundamental. No entanto, sua implementação possui alguns gargalos, especialmente em populações de baixo índice socioeconômico, já que a metodologia padrão-ouro para detecção do SARS-CoV-2 é o RT-PCR em amostras de swab nasofaríngeo, exigindo infraestrutura dedicada à coleta, laboratórios sofisticados e equipe especializada. Portanto, a necessidade de testes rápidos, simples e precisos para diagnosticar a infecção por SARS-CoV 2 é de extrema importância, bem como a validação destes ensaios em outras alternativas de amostras de mais fácil obtenção, como a saliva. Os sistemas utilizando CRISPR para o diagnóstico de COVID-19 tem se apresentado como promissores, já que apresentam alta sensibilidade, rapidez de detecção e não requerem laboratórios especializados. OBJETIVO: Otimizar métodos moleculares para a detecção do SARS-CoV-2 em amostras de saliva e validar um protótipo de teste molecular "point of care" baseado na tecnologia CRISPR/Cas12. METODOLOGIA: Trata-se de um estudo de corte transversal envolvendo 103 participantes, no período de março a maio de 2021, submetidos à coleta de amostras pareadas de swab nasofaríngeo e saliva. Para a validação do RT-PCR em amostras de saliva, foram utilizados três kits comerciais e diferentes protocolos pré-analíticos envolvendo a etapa de extração e condições de armazenamento/estabilidade das amostras. Para o teste rápido com CRISPR/Cas12 foram avaliadas 29 amostras no período de janeiro a fevereiro de 2022 e desenhados três de grupos de primers para a reação de amplificação isotérmica (LAMP) e os respectivos gRNAs com primers fluorescentes para a detecção do complexo RNA-proteína através da clivagem no fluxo lateral. RESULTADOS: Observou-se 100% e 89,1% de concordância comparando amostras de saliva em AllplexTM e TaqPathTM com RT-PCR em amostra de swab, respectivamente. A análise de estabilidade da saliva demonstrou capacidade de detecção do SARS-CoV-2 em amostras armazenadas por 30 dias a -80oC. O ensaio CRISPR/Cas12 mostrou 100% de concordância entre os resultados obtidos por RT- PCR, com limite de detecção de 15,6 PFU. Não foi observada reação cruzada com outros vírus respiratórios. O método RT-PCR apresentou uma sensibilidade de aproximadamente 8 cópias de RNA/µL e o CRISPR/Cas12 de 84 cópias de RNA/µL. CONCLUSÃO: A saliva é uma amostra sensível para o diagnóstico da COVID-19. Nosso estudo mostra evidências de que é possível identificar indivíduos com infecção assintomática sem a necessidade de extração de RNA e solução estabilizadora de RNA, tornando assim o diagnóstico de saliva promissor para testes diretos na rotina laboratorial. O ensaio CRISPR/Cas12 oferece uma alternativa promissora mais rápida para a detecção de SARS-CoV-2, mas novos estudos são necessários para que este método seja validado.