Caracterização molecular e expressão fenotípica da enzima urease de Sporothrix brasiliensis

• Ano de defesa: 2016
• Autor(a) principal: Oliveira, Luã Cardoso de
• Orientador(a): Oliveira, Rosely Maria Zancope, Paes, Rodrigo de Almeida
• Tipo de documento: Dissertação
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Link de acesso: https://www.arca.fiocruz.br/handle/icict/25381

Desde 1998 se observa a maior e mais duradoura epidemia de esporotricose causada principalmente por Sporothrix brasiliensis transmitida por felinos no Rio de Janeiro, com mais de 4.000 casos humanos diagnosticados até o presente. Amplo espectro clínico é observado em pacientes provenientes desta epidemia, e sabe-se que estes podem estar associados com o estado imunológico do hospedeiro. Entretanto, não se pode descartar que a virulência dos isolados de S. brasiliensis possa gerar formas mais graves da doença. Em face da vasta gama de defesas imunológicas, fungos dimórficos são bem efetivos no estabelecimento de infecção, delineando assim a necessidade de um entendimento maior dos mecanismos da patogênese e dos seus fatores de virulência. Embora se tenha demonstrado que espécies clínicas do complexo Sporothrix produzem urease, até o presente o gene codificador da urease neste complexo ainda não foi identificado em todas as espécies, e consequentemente seu papel como fator de virulência é desconhecido. Assim, o objetivo geral deste trabalho foi caracterizar e isolar parcialmente o gene codificador da urease (URE) de S. brasiliensis e estabelecer o modelo tridimensional preditivo desta enzima. Para tanto, foram desenhados iniciadores a partir da análise por métodos computacionais usando como molde a sequência do gene URE de Sporothrix schenckii depositadas no European Nucleotide Archives (ENA), no site Primer3, e o isolamento parcial do gene SbURE foi realizado através de sequenciamento, a partir do DNA da cepa-tipo de S.brasiliensis (CBS 120339) que é produtora de urease de acordo com análise fenotípica A partir da sua sequencia de aminoácidos, depositada no banco de dados do NCBI foi utilizada para a descrição do sítio catalítico, alinhamento com sequencia de aminoácidos de S. schenckii e o desenho preditivo da proteína. Após a caracterização do gene outros três isolados provenientes de pacientes com diferentes formas clínicas da esporotricose, bem como um isolado urease negativo (S.brasiliensis IPEC-654-H), foram incluídos no estudo, para verificação da expressão de urease em meio de cultivo e testes moleculares. As provas fenotípicas demonstraram que todos os isolados do estudo, com exceção de um foram capazes de produzir urease em meio de cultura. Os iniciadores escolhidos foram capazes de hibridizar na sequencia e isolar uma região parcial do gene codificador para urease em todos os isolados, demonstrando 98% de identidade com a mesma região parcial em S. schenckii, assim como a sequencia de aminoácidos quando alinhadas. Através do desenho preditivo tridimensional da urease de S. brasiliensis, foi possível a identificação seu sítio catalítico, em comparação com outras ureases, de plantas e bactérias, estabelecendo assim sua identidade. Mais estudos, como por exemplo estudos in vivo, são necessários para um maior entendimento do papel dessa enzima na infecção por fungos do complexo Sporothrix spp