Obtenção e caracterização molecular de mosquitos Aedes fluviatilis transgênicos para o bloqueio da malária aviária

• Ano de defesa: 2007
• Autor(a) principal: Rodrigues, Flávia Guimarães
• Orientador(a): Moreira, Luciano Andrade, Brito, Cristiana Ferreira Alves de
• Tipo de documento: Tese
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Link de acesso: https://www.arca.fiocruz.br/handle/icict/4026

A manipulação genética de mosquitos possibilita a inserção de moléculas efetoras que podem inibir o desenvolvimento de espécies de Plasmodium. O presente trabalho teve como objetivo estudar duas moléculas antiparasíticas [gomesina e fosfolipase A2 (PLA2m)] como candidatas à expressão em mosquitos. O peptídeo antimicrobiano gomesina da aranha Acanthoscurria gomesiana, foi capaz de inibir o desenvolvimento das formas sanguíneas das cepas W2 e 3D7-GFP de P. falciparum, com valores de IC50 de 75,8 e 86,6µM, respectivamente. Além disso, mostramos que esta molécula na concentração foi capaz de reduzir em até 100% o desenvolvimento de oocinetos de P. berghei (a 50µM) e oocistos de P. falciparum (a 100µM) Anteriormente, experimentos in vitro, mostraram que a enzima fosfolipase A2 (PLA2) isolada do veneno de abelha apresentou ação inibitória sobre o desenvolvimento de P. falciparum e P. gallinaceum, mas apresentou efeitos deletérios em mosquitos transgênicos, quando na sua forma ativa. Neste trabalho, expressamos em bactérias e purificamos uma forma mutante da proteína (PLA2m). Na concentração de 0,1µmol/l a proteína recombinante foi capaz de reduzir em até 79% o número de oocistos de P. gallinaceum em mosquitos Aedes fluviatilis, quando adicionada ao sangue de aves domésticas (Gallus gallus domesticus) infectadas. Para a geração de mosquitos transgênicos utilizamos o promotor da proteína 1 da matriz peritrófica de An. gambiae (AgPer1) para dirigir a expressão do gene da PLA2m. A construção do gene híbrido (AgPer1/PLA2m) foi inserida no elemento de transposição piggyBac, que contém como marcador, o gene da proteína verde fluorescente melhorada (EGFP). Pela microinjeção de 770 embriões, foram formadas 15 famílias e, após a seleção de cerca de 22.000 larvas foram obtidas quatro linhagens transgênicas, representando uma eficiência na transformação de 27%. A expressão do EGFP foi observada no tubo neural e olhos de larva, pupa e adulto. Utilizando iniciadores específicos, confirmamos, pela PCR, a presença dos genes EGFP (700pb) e PLA2m (500bp). A produção do RNAm da PLA2m foi específica no intestino de fêmeas, não variando após a alimentação sanguínea. Por microscopia confocal detectamos a presença da proteína PLA2m no intestino dos mosquitos transgênicos. Além disso, ensaios de bloqueio ao parasita mostraram redução significativa do desenvolvimento de oocistos de P. gallinaceum, de 17,5 a 68,5%, nas quatro linhagens transgênicas. Este estudo mostra a importância de moléculas efetoras e da geração de mosquitos transgênicos como estratégia alternativa de controle da malária, bem como, uma ferramenta para estudos de interação parasita/ vetor invertebrado.