Infecção por tripanosomatídeos em morcegos (Mammalia: Chiroptera) capturados em diferentes áreas do Brasil e desenvolvimento de uma PCR Multiplex como ferramenta diagnóstica da infecção por Leishmania spp. em mamíferos silvestres

• Ano de defesa: 2017
• Autor(a) principal: Pires, Renata de Cássia
• Orientador(a): Roque, André Luiz Rodrigues
• Tipo de documento: Tese
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Link de acesso: https://www.arca.fiocruz.br/handle/icict/25646

A capacidade de voo verdadeiro dos morcegos os permite explorar uma diversidade de ambientes com características epidemiológicas distintas. Embora sejam hospedeiros de outros tripanosomatídeos, sua participação no ciclo de transmissão de Leishmania spp. ainda é subestimada. Nesse sentido buscamos identificar a infecção em amostras de baço de morcegos previamente coletadas em seis localidades do Brasil, além de duas expedições realizadas em uma área de transmissão de Leishmaniose (Rebio Guaribas/PB). Entendendo a necessidade de refinar o diagnóstico molecular no sentido de evitar resultados falso-negativos, padronizamos um sistema de PCR Multiplex capaz de detectar simultaneamente a infecção por Leishmania spp. através do kDNA e a viabilidade da amostra por meio da detecção de um fragmento de DNA constitutivo do hospedeiro mamífero (gapdh). Das amostras de baço previamente coletadas 23,2% (32/138) foram positivas para Leishmania spp. As coletas realizadas na Rebio resultaram em 354 morcegos capturados, dos quais 183 foram examinados frente a infecção por tripanosomatídeos. Em quatro animais foi possível o isolamento de três espécies de Trypanosoma, a saber: T. cruzi TcI, T. dionisii, além do primeiro relato de T. marinkelei em Micronycteris minuta. Não foi possível o isolamento de Leishmania spp. entre as culturas de fragmentos de pele, baço ou fígado, entretanto no diagnóstico molecular 37,7% (69/183) foram positivos para o kDNA de Leishmania spp. Sete espécies, do total de 15 analisadas, foram relatadas, pela primeira vez, como hospedeiros de Leishmania spp. no Brasil. No geral, dentre as 101 amostras kDNA positivas, realizamos a PCR direcionada para o marcador HSP70(234) em 64, com amplificação de 76,5% delas (n=49). Destas, 37 foram submetidas ao sequenciamento, porém não obtiveram qualidade suficiente para serem analisadas A clonagem gênica foi realizada em 27 amostras, porém não foi possível a identificação do inserto e a caracterização das espécies. O sistema de PCR Multiplex foi desenhado para detectar um fragmento de 212pb do domínio catalítico do gene constitutivo gapdh, dentro das condições previamente estabelecidas para o diagnóstico de 120pb do kDNA de Leishmania spp. As melhores condições de amplificação foram obtidas usando tanto a enzima TaqDNA HiFidelity quanto o pré-mix de PCR por beads (Ge Healthcare®) sob a seguinte ciclagem: 95°C por 1 min, seguido de 30 ciclos de 95°C por 30 segundos, 61°C por 30 segundos e 72°C por 30 segundos e extensão final a 72°C for 1 min. O teste foi capaz de detectar até 0,1ng de DNA de Leishmania em 100ng de DNA de mamífero. A técnica se mostrou eficaz quando testadas em amostras de 106 mamíferos silvestres, utilizando tecidos de pele, baço e fígado, de mais de 20 espécies de mamíferos silvestres de quatro ordens: Chiroptera, Didelhimorphia, Lagomorpha e Rodentia. A reprodutibilidade da técnica permite que este teste possa ser incorporado a rotina do diagnóstico molecular de Leishmania spp. em mamíferos silvestres. A diversidade de morcegos naturalmente infectados e o seu encontro em todas as localidades analisadas, demonstra que esses animais são hospedeiros de espécie(s) de Leishmania em diferentes regiões do país, incluindo áreas endêmicas da parasitose e que o seu papel como reservatórios silvestres ainda necessita ser melhor definido. O monitoramento contínuo destes animais em expedições que busquem não somente o diagnóstico da infecção por Leishmania sp, mas que avancem no sucesso da caracterização em nível específico, é fundamental para o conhecimento das espécies envolvidas em cada localidade, em especial devido à complexidade e dinamicidade da transmissão destes parasitos na natureza.