Filogenia da sensibilidade da acetilcolinesterase cerebral de peixes ao metil-paraoxon como um possível marcador ambiental

• Ano de defesa: 2009
• Autor(a) principal: Freitas, Amanda Pereira de
• Orientador(a): Arias, Ana Rosa Linde
• Tipo de documento: Dissertação
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Palavras-chave em Português: Acetilcolinesterase; Filogenia; Metil-paraoxon; Biomarcador
• Link de acesso: https://www.arca.fiocruz.br/handle/icict/2324

Todos os animais com células nervosas e musculares possuem a enzima acetilcolinesterase (EC 3.1.1.7, AChE) e essa seqüência de aminoácidos está presente em muitas outras proteínas, com ou sem atividade catalítica, fato que permite que essa proteína seja utilizada em estudos de filogenia e de evolução. A grande diferença de afinidade entre substratos e inibidores é utilizada como um biomarcador para estudos genéticos de vários grupos de animais, especialmente insetos. Peixes possuem uma grande diferença na sensibilidade da AChE ao metil-paraoxon (MP) em relação aos animais terrestres e essa diferença pode estar relacionada à evolução. As constantes cinéticas de inibição (CCI) para o mecanismo de inibição progressivamente irreversível da AChE cerebral ao MP foram determinadas em duas fontes de AChE como um modelo para avaliação do potencial de uso das CCI como biomarcador para estudos evolucionários e filogenéticos. As CCI da AChE cerebral de seis exemplares de tainha (Mugil liza), coletados em duas lagoas da costa do Estado do Rio de Janeiro (Araruama e Saquarema), em tempos diferentes (2005 e 2007, respectivamente), foram determinadas em dois laboratórios distintos (CESTEH - FIOCRUZ e Dept. Bioquímica - UERJ). As CCI, medidas separadamente em cada exemplar, indicaram que essas constantes são preservadas em todos os exemplares de uma mesma espécie e que a metodologia empregada pode ser conduzida em laboratórios distintos sem grandes variações. A AChE cerebral de tainha foi tomada como um exemplo de enzima menos sensível (IC50 = 2118nM) e a de galinha comercial (Gallus gallus domesticus) como um exemplo de uma enzima muito mais sensível ao MP (IC50 = 26nM). Alguns testes foram feitos para a validação dessa metodologia. A AChE cerebral dessas duas fontes de enzima foi parcialmente purificada descartando o sobrenadante do homogeneizadoe solubilizando o sedimento com o detergente Triton X-100. A inibição da atividade de AChE nessas preparações pelo substrato acetiltiocolina, comportamento típico da AChE, comprovou a homogeneidade dessa atividade enzimática como representativa da AChE verdadeira em cada animal. A utilização do MP permitiu aferir as soluções de inibidorcom métodos colorimétricos no momento do uso e a preparação solúvel de AChE eliminou artefatos insolúveis que atrapalham a quantificação da enzima. Algumas características matemáticas do cálculo das CCI foram discutidas e um modelo foi validado para ser utilizado em estudos de evolução e filogenia de peixes marinhos da costa brasileira. Como a AChE cerebral de todos os animais terrestres, cujos resultados estão disponíveis, é muito mais sensível ao MP, exemplares de uma espécie de baiacu (baiacu-arara, Lagocephaluslaevigatus) foram testados como um exemplo de peixe mais jovem na escala evolutiva. Os resultados das CCI da AChE cerebral para essa espécie (IC50 = 2243nM) indicaram que entre os peixes a idade evolutiva não está correlacionada com a sensibilidade aos organofosforados. A AChE mais sensível entre os peixes testados foi a de um tipo de bagre (bagre-branco, Genidens barbus, IC50 = 606nM) e a enzima do cação-frango (Rhizoprionodonporosus), exemplo de um peixe mais antigo na evolução, apresentou uma sensibilidade intermediária (IC50 = 1280nM). Estudos com outras espécies correlacionadas com aquelas que se mostraram mais sensíveis ao MP terão que ser feitos para uma resposta mais adequada sobre o uso das CCI de inibição da AChE cerebral por MP como possível marcador evolutivo e filogenético.