Autophagosome biogenesis and axonal transport dysfunction in Alzheimer's disease

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Main Author: Santos, Alexandra Filipa Almeida
Publication Date: 2022
Format: Master thesis
Language: eng
Source: Repositórios Científicos de Acesso Aberto de Portugal (RCAAP)
Download full: https://hdl.handle.net/10316/102862
Summary: Dissertação de Mestrado em Biologia Celular e Molecular apresentada à Faculdade de Ciências e Tecnologia
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spelling Autophagosome biogenesis and axonal transport dysfunction in Alzheimer's diseaseDisfunção da biogénese e transporte axonal do autofagossoma na doença de AlzheimerAlzheimer´s DiseaseAβOIntra-axonal autophagyAutophagosome biogenesisAutophagosome transportDoença de AlzheimerAβOAutofagia intra-axonalBiogénese do autofagossomaTransporte do autofagossomaDissertação de Mestrado em Biologia Celular e Molecular apresentada à Faculdade de Ciências e TecnologiaA doença de Alzheimer (DA) é uma doença neurodegenerativa progressivacaracterizada por disfunção sináptica, degeneração axonal, e morte neuronal. Aagregação e consequente acumulação do peptídeo beta amilóide (Aβ), derivado daclivagem da proteína precursora amilóide (APP), é muito acentuada na DA. Emparticular, a acumulação de Aβ na forma de oligómeros (AβO) solúveis e em placasextracelulares insolúveis encontram-se marcadamente presentes na DA. Nos últimosanos, vários estudos demonstraram que a neurotoxicidade observada na DA se relacionabastante com os efeitos induzidos pelos AβO, dada a sua capacidade de se ligar comgrande afinidade aos neurónios. Entre outras características, a acentuada acumulaçãopatológica de proteínas observada no cérebro de pacientes com DA tem vindo a sugerirque a desregulação do processo de autofagia tem um papel fundamental na patogénesedesta doença neurodegenerativa. A autofagia é um processo responsável peladegradação e reciclagem de componentes celulares. Este processo é altamenteregulado por proteínas como a LC3B e as proteínas de repetição WD que interagem comfosfoinositídeos (WIPI), as quais controlam a formação e maturação do autofagossoma.Nos neurónios, a biogénese dos autofagossomas ocorre de forma constitutivamaioritariamente na parte distal do axónio. A maturação do autofagossoma inicia-sedurante o seu transporte retrógrado para o soma, onde ocorre a degradação doscomponentes abrangidos pelo autofagossoma. A regulação de todo este processo éextremamente importante para a manutenção da homeostase celular, incluindo para afuncionalidade sináptica. Estudos recentes demonstraram que durante oenvelhecimento celular os autofagossomas sofrem alterações estruturais e a suaprodução diminui. Assim, surgiu a nossa hipótese de que nas fases iniciais dodesenvolvimento da DA os AβO afetam a biogénese intra-axonal dos autofagossomas,agravando os efeitos do envelhecimento e levando, em última instância, a disfunçãoaxonal. Dados recentes (não publicados) do nosso laboratório indicam que os AβOinduzem alterações rápidas nos níveis intra-axonais de proteínas relacionadas com aautofagia (nomeadamente, LC3B e WIPI2) em culturas primárias de neurónios dehipocampo de rato, através de um mecanismo que envolve recetores N-metil DAspartato (NMDA) e a proteína quinase II dependente de Cálcio/calmodulina (CaMKII).12Neste trabalho, de modo a complementar e corroborar os nossos estudosanteriores, continuámos a analisar os efeitos dos AβO na autofagia nas fases iniciais daDA. Dada a importância da fosforilação da WIPI2 como interruptor molecular para aformação do autofagossoma, analisámos as vias envolvidas nestas alterações e tambéminvestigámos os possíveis mecanismos através dos quais os AβO afetam o transporteintra-axonal do autofagossoma. Em resumo, descobrimos que murganhos 3xTg-ADjovens também apresentam alterações nas proteínas autofágicas LC3B e WIPI2,similarmente aos nossos dados anteriores observados in vitro. Além disso, utilizandoculturas de neurónios de hipocampo de rato, observámos que a inibição da proteínafosfatase 2A (PP2A) tem um efeito cumulativo ao desencadeado pelos AβO nafosforilação da WIPI2. Além disso, observámos que os AβO alteram os níveis intraaxonais da proteína motora-adaptadora 1 que interage com a proteína Junk (JIP-1) einduz alterações no movimento dos autofagossomas ao longo da parte distal dosaxónios. Estes resultados foram obtidos por imunocitoquímica, western blot, emicroscopia com células vivas.De um modo geral, estes resultados forneceram novas evidências sobre osmecanismos envolvidos no stress autofágico intra-axonal associado aos estados iniciaisda DA, identificando novas proteínas que são alteradas pelos AβO. Juntamente com ociclo de fosforilação WIPI2, estas proteínas podem ser futuros alvos para abordagensfarmacológicas capazes de aliviar a disfunção sináptica e axonal observada nestadoença.Alzheimer´s disease (AD) is a progressive neurodegenerative disordercharacterized by synaptic impairment, axonal degeneration, and neuronal death. Theaggregation and consequent accumulation of amyloid-β (Aβ) peptide, derived from thecleavage of the amyloid precursor protein (APP), is highly pronounced in AD. Inparticular, the accumulation of toxic soluble Aβ oligomers (AβO) and insoluble Aβextracellular plaques are considered main hallmarks of the disease. In the past years,several studies demonstrated that AβO bind with high affinity to neurons and have beenpointed as the main culprit for the neurotoxicity observed in AD. Among other features,the pronounced pathological accumulation of proteins observed in the brain of patientswith AD has long suggested a role for autophagy dysregulation in the pathogenesis ofthis neurodegenerative disorder. Autophagy is an essential system for the degradationand recycling of cellular components. This process is highly regulated by proteins suchas LC3B and WD-repeat protein interacting with phosphoinositide (WIPI), which controlautophagosome formation and maturation. In neurons, constitutive biogenesis ofautophagosomes occurs mainly in the distal axon. Their maturation occurs along theirretrograde transport to the soma, where engulfed components´ degradation mainlyoccurs. This well-orchestrated mechanism is required for the maintenance of cellhomeostasis, including the proper function of synapses. Recent evidence demonstratedthat autophagosomes undergo structural changes and their production decreasesduring ageing. Therefore, in our lab, we hypothesised that, in the early stages of ADdevelopment AβO affect intra-axonal autophagosome biogenesis, worsening the effectsof ageing and ultimately leading to impaired axonal function. The most recentunpublished data from our lab denotes that AβO rapidly alter the intra-axonal levels ofautophagy-related proteins (i.e., LC3B and WIPI2) in primary cultures of rat hippocampalneurons, by a mechanism involving NMDA receptors and Calcium / calmodulindependent protein kinase II (CaMKII).Here, to complement and corroborate our previous work, we continued to studythe effects of AβO on autophagy at the early stages of AD. Given the importance ofWIPI2 phosphorylation as a molecular switch for autophagosome formation, we furtherstudied the pathways involved in these changes and also investigated the putative10mechanisms by which AβO affects intra-axonal autophagosome transport. Briefly, wefound that young 3xTg-AD mice also exhibit alterations in autophagy-related proteinsLC3B and WIPI2, which was in accordance with our previous in vitro data. Furthermore,using cultured rat hippocampal neurons, we observed that inhibition of proteinphosphatase 2A (PP2A) has a cumulative effect with AβO in the phosphorylation ofWIPI2. Additionally, we found that AβO alters the intra-axonal levels of the motoradaptor protein Junk interacting protein 1 (JIP-1) and causes the abnormal movementof autophagosomes along the distal part of axons. These results were obtained byimmunocytochemistry, western blot, and live-imaging microscopy.Overall, these findings provided new mechanistic insights into the early ADassociated intra-axonal autophagic stress and identified new targets of AβO action.Together with the WIPI2 phosphorylation cycle, these new targets can be future aimsfor pharmacologic approaches capable of alleviate the synaptic and axonal dysfunctionobserved in this disease.FCT2022-09-232028-09-21T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesishttps://hdl.handle.net/10316/102862https://hdl.handle.net/10316/102862TID:203077040engSantos, Alexandra Filipa Almeidainfo:eu-repo/semantics/embargoedAccessreponame:Repositórios Científicos de Acesso Aberto de Portugal (RCAAP)instname:FCCN, serviços digitais da FCT – Fundação para a Ciência e a Tecnologiainstacron:RCAAP2025-04-02T17:10:43Zoai:estudogeral.uc.pt:10316/102862Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireinfo@rcaap.ptopendoar:https://opendoar.ac.uk/repository/71602025-05-29T05:52:27.324116Repositórios Científicos de Acesso Aberto de Portugal (RCAAP) - FCCN, serviços digitais da FCT – Fundação para a Ciência e a Tecnologiafalse
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