Exploring quinone reductases from pathogenic bacterium Staphylococcus aureus
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| Publication Date: | 2024 |
| Format: | Master thesis |
| Language: | eng |
| Source: | Repositórios Científicos de Acesso Aberto de Portugal (RCAAP) |
| Download full: | http://hdl.handle.net/10400.5/96997 |
Summary: | Tese de Mestrado, Bioquímica e Biomedicina, 2024, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências |
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Exploring quinone reductases from pathogenic bacterium Staphylococcus aureusStaphylococcus aureusMetabolismo energéticoPiruvato quinona oxidoreductaseTeses de mestrado - 2024Domínio/Área Científica::Ciências Naturais::Ciências QuímicasTese de Mestrado, Bioquímica e Biomedicina, 2024, Universidade de Lisboa, Faculdade de CiênciasStaphylococcus aureus é um agente patogénico oportunista com uma grande versatilidade para colonizar diferentes ambientes. Este patógeno é capaz de colonizar praticamente todos os tecidos do corpo humano, causando doenças com diferentes manifestações e graus de severidade. Estas infeções são tratadas com antibióticos, no entanto, a continua exposição de S. aureus a estes, outrora eficazes para o seu combate, levou ao aparecimento de estirpes resistentes à meticilina (MRSA). Apesar de existirem antibióticos específicos e eficazes contra MRSA, esta é responsável pela maioria dos casos de infeções nosocomiais, especialmente em ambientes hospitalares, tornando-se uma ameaça para a saúde pública. MRSA é responsável pelo maior número de mortes por infeção, em indivíduos com idade superior ou igual aos quinze anos. Desta forma, o desenvolvimento de novos fármacos para combater este patógeno é prioritário. Compreender e identificar quais os fatores que conferem versatilidade a este microrganismo podem ser propostos como alvos terapêuticos. Alguns dos fatores que se sabem ser fundamentais para a sobrevivência deste organismo patogénico estão relacionados com o metabolismo energético e com a cadeia respiratória do mesmo. Assim, visando alargar os conhecimentos nestas áreas, o trabalho desenvolvido no âmbito desta dissertação focou-se na investigação da proteína piruvato quinona oxidoreductase (PQO), a qual se encontra possivelmente associada à cadeia respiratória de S. aureus. Esta investigação levou a uma caracterização integrada da PQO a níveis moleculares e celulares. Segundo a literatura a PQO é uma proteína monotópica, isto é, que se liga somente a um lado da membrana, e catalisa a descarboxilação oxidativa de piruvato a acetato com a redução de menaquinona a menaquinol, fornecendo assim este substrato à cadeia respiratória. Realizou-se, primeiramente, uma análise in silico desta proteína de maneira a formular hipóteses quanto à sua estrutura, nomeadamente, domínios e locais de ligação à membrana. A partir destas análises foi possível verificar que a PQO é maioritariamente composta por hélices alfa, cerca de 61 %, assim como outras proteínas monotópicas. De acordo com a literatura pode-se determinar os locais de ligação dos substratos e cofatores à proteína com base em softwares de predição. Procedeu-se assim à identificação dos domínios que a proteína contém, sendo estes: dois domínios de ligação ao pirofosfato de tiamina (TPP), um domínio de ligação à flavina (FAD) e o C-terminal. Por fim, e tendo em conta o comportamento de proteínas que desempenham a mesma função, mas em outros organismos, em particular a piruvato oxidase de E. coli, realizou-se um estudo quanto à função do C-terminal da PQO de S. aureus. Neste verificou-se que o C-terminal pode ser considerado o responsável pela ligação da PQO à membrana de S. aureus e estudos preliminares de docking molecular sugerem também que é no C-terminal que ocorre a interação da menaquinona com a proteína. A produção de PQO recombinante de S. aureus foi realizada na estirpe Rosetta de E. coli. Através de vários passos de purificação foi possível obter extratos solúveis, que foram submetidos a uma cromatografia de afinidade, na qual se adquiriu frações contendo PQO. A pureza foi avaliada por géis de SDS-PAGE. Foi igualmente avaliada a capacidade redox da proteína para determinar a viabilidade da mesma para futuros testes de atividade. Tratando-se de uma flavoproteína, ou seja, que contém FAD como cofator, a PQO apresenta um espetro de absorção UV-visível característico, com bandas a 375 nm e a 450 nm, quando no estado oxidado. A redução da proteína e, consequentemente, do FAD leva ao desaparecimento destas bandas. Deste modo, é possível seguir o estado de oxidação da PQO pelos diferentes espectros de absorção UV-visível. Através das análises realizadas verificou-se que a PQO isolada era reduzida por piruvato e oxidada por 2,3-Dimethyl-1,4-naphthoquinone (DMN), um análogo da menaquinona. Assim, conclui-se que a PQO se encontra redox ativa e é capaz de utilizar aqueles dois compostos como substratos. Para que a reação da PQO ocorra, segundo a literatura, é necessária a presença de FAD, TPP e Mg2+ como cofatores. A dependência destes cofatores foi confirmada em ensaios de atividade enzimática com a PQO presente na membrana, no entanto, verificou-se ainda que outro componente importante para a mesma era a presença de fosfatos. A importância destes sugere que a reação da PQO leva à formação de acetil-fosfato em vez de acetato como produto final. Diferentes substratos aceitadores de eletrões (DCPIP, DMN e citocromo c) foram testados na reação enzimática da PQO. Os resultados obtidos sugerem que o local de ligação à DMN na PQO isolada possa estar obstruído, dado que a atividade especifica em DMN e DMN-citocromo c foi menor que o esperado. Por outro lado, verificou-se que a atividade especifica com DCPIP era bastante superior à dos outros dois aceitadores de eletrões o que sugere que este tenha um local de ligação diferente do local onde o DMN se liga, permitindo-lhe uma maior acessibilidade. Desta forma, utilizando DCPIP como aceitador de eletrões, elaborou-se o perfil de pH para a PQO de modo a verificar-se qual o pH ideal para a atividade enzimática da proteína. A partir do valor obtido, pH 6.25, realizaram-se os ensaios cinéticos dos quais se concluiu que a atividade da PQO é inibida por um dos seussubstratos, neste caso, o piruvato, e por citrato. De modo a estudar a interação proteína-substrato realizaram-se ensaios de fluorescência da emissão dos triptofanos, nos quais se observou um quenching de fluorescência aquando da adição dos substratos testados. Estes revelaram que a PQO tem uma afinidade semelhante para o piruvato e para a DMN e que esta é maior do que a afinidade da PQO para o citrato. Estes resultados estão de acordo com o esperado, dado que o piruvato e a menaquinona são os substratos da proteína in vivo. A realização dos mesmos ensaios, mas na presença do inibidor citrato, revelaram ainda que a afinidade da PQO para a DMN e para o piruvato não é afetada pela sua presença, sugerindo assim que a inibição do citrato ocorre por um mecanismo não competitivo. O estudo da importância da PQO para S. aureus foi realizado através de ensaios celulares em que se fez o crescimento das estirpes de S. aureus MW2 wild type e knockout do gene da pqo. Estes estudos revelaram que a PQO desempenha um papel crucial na sobrevivência de S. aureus em condições com excesso de glucose, sendo que dos três crescimentos em excesso de glucose (10 mM, 14 mM e 15 mM), apenas na condição com a menor concentração de glucose a estirpe ∆pqo sobreviveu. Os ensaios sugerem também que a expressão da PQO é influenciada pelo pH do meio, mas especialmente pela concentração de glucose, em que uma maior concentração leva à maior expressão de PQO. Observouse que quanto maior a concentração inicial de glucose no meio, menor era o pH deste às 5 horas de crescimento, indicativo de uma maior produção de acetato. Através desta observação é provável que a importância da PQO na sobrevivência de S. aureus esteja relacionada com o mecanismo de inibição de expressão de cidC, gene que codifica a PQO. Sob stress acídico, o gene cidA inibe a expressão de cidC, levando a menores quantidades de PQO e, consequentemente, menor quantidade de acetato produzido. Em suma, os resultados obtidos neste trabalho avançaram a nossa compreensão do enzima piruvato quinona oxidoreductase, bem como reforçam a hipótese de se tratar de uma proteína da cadeia respiratória de S. aureus. Revelaram ainda que esta proteína é essencial para a sobrevivência de S. aureus em condições com excesso de glucose.Staphylococcus aureus is an opportunistic pathogen and represents the most frequent cause of nosocomial infections. As cases of S. aureus infection increase, various antibiotics have been developed. Although these are viable strategies to treat these infections, new strains of S. aureus with resistance to antibiotics continue to emerge. This has led S. aureus to become a major global health issue, making the development of new drugs against this pathogen urgent. Since energy metabolism is essential to all organisms, studying the proteins and mechanisms involved in it may lead to novel approaches for targeting this pathogen. We aim to contribute to the understanding of S. aureus metabolism by exploring pyruvate:quinone oxidoreductase (PQO), a monotopic protein hypothesized to be involved in its respiratory chain. We performed a throughout characterization involving biochemical, biophysical, and cellular methodologies. In silico analyses of PQO indicate that its C-terminal is responsible for the binding to the membrane and for the interaction with menaquinone. Optimal conditions for PQO’s activity were determined, showing that it exhibits maximal activity at pH 6.25. The kinetic parameters were obtained, indicating that PQO’s reaction is inhibited by one of its own substrates, pyruvate. Activity assays performed with 2,3-Dimethyl-1,4-naphthoquinone (DMN) support the idea that PQO uses menaquinone as an electron acceptor in vivo, and therefore is part of the respiratory chain of S. aureus. Citrate was shown to act as an inhibitor of PQO’s reaction through a non-competitive mechanism. Cellular analysis revealed that PQO is crucial for S. aureus survival at high levels of glucose and suggested that PQO’s expression is influenced by glucose concentration and pH. Overall, these findings improve our understanding of PQO’s role in S. aureus and its relevance to the pathogen’s survival in high glucose environments.Pereira, Manuela M.Repositório da Universidade de LisboaSantos, David Rafael Machado dos202420242026-10-30T00:00:00Z2024-01-01T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10400.5/96997enginfo:eu-repo/semantics/embargoedAccessreponame:Repositórios Científicos de Acesso Aberto de Portugal (RCAAP)instname:FCCN, serviços digitais da FCT – Fundação para a Ciência e a Tecnologiainstacron:RCAAP2025-03-17T16:31:28Zoai:repositorio.ulisboa.pt:10400.5/96997Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireinfo@rcaap.ptopendoar:https://opendoar.ac.uk/repository/71602025-05-29T04:18:06.617823Repositórios Científicos de Acesso Aberto de Portugal (RCAAP) - FCCN, serviços digitais da FCT – Fundação para a Ciência e a Tecnologiafalse |
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