APP and APP phosphorylation in Gα0-induced STAT3 signaling

• Main Author: Cerqueira, Ana Regina Silva
• Publication Date: 2012
• Format: Master thesis
• Language: eng
• Source: Repositórios Científicos de Acesso Aberto de Portugal (RCAAP)
• Download full: http://hdl.handle.net/10773/10719
• topic: Biomedicina; Proteínas; Fosforilação; Doença de Alzheimer

A proteína precursora de amilóide de Alzheimer (PPA) é uma proteína cerebral fundamental, envolvida em mecanismos celulares como a adesão e migração celular e neuritogénese. Como fosfoproteína, a PPA apresenta oito resíduos fosforiláveis no seu domínio citoplasmático. Um desses resíduos, Serina 655 (S655), localiza-se no motivo funcional 653YTSI656, e a sua fosforilação altera o tráfego e o processamento da PPA, podendo ainda mediar a ligação desta a outras proteínas através de um hydrophobic pocket localizado imediatamente a jusante ao motivo YTSI (657His-Lys676). Nomeadamente, a proteína Gαo, uma subunidade α de proteínas G heterotrimérica, liga-se à PPA neste local. A Gαo está envolvida em várias cascatas de sinalização e é o membro da família Gi/o mais abundante no cérebro. Quando ativada, a Gαo consegue induzir fatores de crescimento relacionados com a via JAK2/STAT3 via Rap, provavelmente através da interação e sequestro de proteínas RapGAP. Adicionalmente, a Gαo foi sugerida como um transdutor da PPA, funcionando esta como um guanidine exchange factor (GEF) para a Gαo. No entanto, ainda não foi atribuído nenhum papel funcional a esta interação. O presente trabalho teve como principal objetivo determinar o papel da PPA na cascata de sinalização da STAT3 induzida por Gαo, pela análise dos efeitos da co-transfecção de PPA-Gαo nos níveis de STAT3 e STAT3 fosforilada através de Western blot. Para isto, células humanas de neuroblastoma SH-SY5Y são co-transfectadas por 6h e 24h com PPA-GFP cDNAs (Wt ou fosfomutantes S655: S655A, SA, e S655E, SE) e Gαo ou GαoCA (um mutante Q205L que mimetiza um estado constitutivamente activo da Gαo). Adicionalmente, foi estudado como é que os metabolismo da PPA e da Gαo afetam-se um ao outro, através da quantificação dos níveis de Gαo, PPA e PPAs secretada por Western blot. Em geral, os resultados obtidos mostram que as co-expressões de PPA-GFPs com Gαo/GαoCA levam a um decréscimo da fosforilação da STAT3 induzida por Gαo. Isto parece ocorrer através da indução de um efeito retro-inibitório nas vias Gαo-STAT3 após a ativação inicial da Gαo e, enquanto este efeito é mais pronunciado para o mutante que reproduz desfosforilação do resíduo S655 da PPA, a fosforilação neste mesmo resíduo parece retardar este efeito. Em concordância, a PPA invariavelmente diminui os níveis de Gαo e a Gαo também diminui os níveis de PPA, potencialmente envolvendo um mecanismo de inibição da ativação da STAT3 induzida pela Gαo através da PPA por degradação lisossomal PPA/Gαo.