APP phosphorylation on APP/Gαo colocalization and STAT3 activation

• Main Author: Dias, Roberto Alexandre dos Santos
• Publication Date: 2012
• Format: Master thesis
• Language: eng
• Source: Repositórios Científicos de Acesso Aberto de Portugal (RCAAP)
• Download full: http://hdl.handle.net/10773/10819
• topic: Biomedicina; Proteínas; Fosforilação; Doença de Alzheimer

A proteína Gαo é uma das subunidades alfa da família das proteínas G heterotriméricas, proteínas envolvidas na transdução de sinais a partir recetores membranares. Gαo é principalmente expressa nos neurónios, encontrando-se localizada ao longo da membrana plasmática, incluindo nos cones de crescimento dos neurónios, onde também se encontra a Proteína Precursora de Amilóide de Alzheimer (PPA), uma proteína membranar com um papel central na doença de Alzheimer. Algumas funções semelhantes já foram atribuídas às duas proteínas, incluindo papéis na diferenciação e migração celular. A ligação da PPA à Gαo já foi descrita, o que pode indicar que a PPA modula as suas funções através da ligação e ativação da Gαo. Também já foi demonstrado que uma das vias pela qual a Gαo leva à neuritogénese é a ativação do transdutor de sinal e ativador da transcrição 3 (STAT3). A Gαo ligase ao domínio C-terminal da PPA, nos aminoácidos His657-Lis676, que pertencem a uma região hidrofóbica imediatamente a jusante do sorting motif 653YTSI656. Isto leva a crer que a ligação entre a PPA e a Gαo pode ser mediada pela fosforilação da PPA no resíduo Serina 655 (S655). Assim, a fosforilação da PPA poderia influenciar a ativação da Gαo e consequente sinalização via STAT3. Neste trabalho, nós estudámos os efeitos da fosforilação da PPA e ativação da Gαo na interação funcional da PPA/Gαo. Isto foi analisado por cotransfeção de células de neuroblastoma humano não diferenciadas (SH-SY5Y) com PPAGFP selvagem ou fosfomutante (PPA com a S655 constutivamente fosforilada ou desfosforilada) e com a Gαo selvagem ou Gαo constutivamente ativa. As células foram sujeitas a ensaios de imunofluorescência e vários parâmetros foram analisados, tais como a colocalização subcelular da PPA e da Gαo, o número de prolongamentos celulares e o seu comprimento, e a intensidade da STAT3 no núcleo. Toda a análise quantitativa feita nas microfotografias foi realizada no software Fiji (ImageJ). Ensaios de Western Blot também foram realizados para avaliar a influência da co-expressão da PPA e Gαo em proteínas do citoesqueleto. Os nossos resultados mostram que a Gαo e a PPA parecem colocalizar principalmente no aparelho de Golgi e nos prolongamentos celulares. Ambas as proteínas parecem cooperar entre si e induzir alterações neuritogénicas, com a Gαo a levar principalmente a uma formação inicial dos prolongamentos e a PPA a atuar na extensão dos mesmos, num modo dependente da fosforilação da S655. Além disso, observou-se que a PPA diminui a ativação da STAT3 induzida pela Gαo, devido provavelmente a um efeito de retroinibição. Estes resultados provam que estas proteínas interagem funcionalmente e o seu potencial valor em aplicações neuritogénicas terapêuticas será estudado em maior detalhe.