Expressão e caracterização das quimases recombinantes específicas de mastócitos de camundongos (mMCP4 e 5)

• Ano de defesa: 2014
• Autor(a) principal: Santana, Ana Carolina
• Tipo de documento: Dissertação
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP
• Palavras-chave em Português: angiogênese; angiogenesis; chymases; mast cells; mastócitos; Pichia pastoris; quimases
• Link de acesso: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/17/17136/tde-18122014-150712/

Os mastócitos, em associação com outras células inflamatórias se acumulam em locais de tumor. Entretanto, pouco é conhecido sobre o papel exato dos mastócitos e de seus mediadores na progressão tumoral e angiogênese. Resultados recentes do nosso laboratório mostraram que a expressão das triptases específicas de mastócitos está correlacionada com a progressão tumoral (de Souza, Jr, PLosOne 7(7): e40790). Além do mais, existe uma associação entre mastócitos e a angiogênese tumoral. Então, tornou-se interessante investigar o papel das quimases específicas de mastócitos (mMCP-4 e -5) neste processo. Visto que estas quimases não são disponíveis comercialmente, a primeira etapa deste estudo foi produzir as quimases mMCP-4 e -5 recombinantes. Assim, as sequências dos genes respectivos para mMCP-4 e -5, além das sequências para seis resíduos de His e do sítio suscetível a enteroquinase foram clonadas no vetor de expressão pPIC9. A cepa GS115 de Pichia pastoris foi transformada com o respectivo vetor para mMCP-4 ou -5. Os clones transformados foram crescidos em meio BMMY e induzidos com várias concentrações de metanol para a produção de mMCP-4 ou -5 recombinantes. Depois de 96 horas, o meio foi centrifugado e as quimases mMCP-4 ou -5 foram purificadas do sobrenadante usando resina de níquel. A identidade das proteínas foi confirmada por Western Blotting usando o anticorpo anti-his, assim como os anticorpos anti-mMCP-4 e -5. As proteases foram ativadas pela clivagem do sítio suscetível a enteroquinase por cinco horas, a 22°C. A ativação das enzimas foi confirmada através da degradação de seus substratos específicos. Estes resultados mostram que P. pastoris é um organismo eficiente para a expressão de ambas as proteases. Estas proteases recombinantes se constituem em ferramentas importantes para se elucidar o papel da mMCP-4 ou -5 na angiogênese.