Expressão recombinante e caracterização funcional da β-amilase de banana produzida em Pichia pastoris

• Ano de defesa: 2013
• Autor(a) principal: Ferreira, Geovana Sagrado
• Tipo de documento: Dissertação
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP
• Palavras-chave em Português: β-amilase; β-amylase; Amido; Banana; Expressão heteróloga; Heterologous expression; Pichia pastoris; Starch
• Link de acesso: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/9/9131/tde-26032014-162250/

Um dos eventos mais importantes durante o amadurecimento da banana é a degradação do amido, concomitante com o acúmulo de açúcares solúveis. Várias enzimas, que supostamente atuam na degradação do amido, já tiveram sua atividade/proteína específica detectadas nesta fase na banana. Entre elas a α-amilase, a β-amilase, as amido-fosforilases, as α-glicosidases e as isoamilases. A síntese do amido e, normalmente, sua degradação, ocorrem dentro do amiloplasto, que possui duas membranas a serem transpostas antes do acesso ao grânulo de amido ou aos produtos da ação de outras enzimas. Uma das isoformas da β-amilase em banana possui um peptídeo de transporte predito em sua seqüência, necessário para transpor estas membranas e entrar no amiloplasto. Uma maneira de contornar a dificuldade em estabelecer a real importância de cada enzima na degradação do amido é isolar os grânulos e as enzimas e submetê-lo à atividade seqüencial das enzimas supostamente responsáveis pela degradação. O ideal é utilizar a enzima endógena, mas o processo de purificação de enzimas em frutos é demorado e nem sempre bom em termos de pureza, quantidade e atividade. Estudos baseados na expressão heteróloga de genes da β-amilase permitiriam melhor compreender os mecanismos de atuação dessa enzima presente na polpa da banana. Assim, foram feitos ensaios de expressão heteróloga em Pichia pastoris na tentativa de produzir essa enzima em quantidade suficiente para purificação, aplicação nos grânulos de amido e produção de anticorpos policlonais. Foram testadas várias condições de indução da proteína, tais como aeração, temperatura, pH, concentração de metanol e tempo de indução, bem como a montagem de uma nova construção gênica com tag de histidina no vetor de expressão pPICZαA com confirmação do fenótipo dos transformantes positivos. Porém, a obtenção de β-amilase recombinante com atividade não foi bem sucedida, necessitando talvez de alterações nesses padrões de indução.